INVESTIGADORES
MORENO Silvia Margarita
congresos y reuniones científicas
Título:
CARACTERIZACION DE UNA PROTEINA DE FUSION GLICOSILADA POR ESPECTROMETRIA DE MASA
Autor/es:
VALACCO, MP; NEME TAUIL, R; FERNANDEZ, JG; PAROLA, A.; COUTO, A.; MORENO, S.
Lugar:
Rosario, Santa Fe
Reunión:
Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometria de Masas; 2016
Institución organizadora:
SAEM
Resumen:
TITULO: CARACTERIZACION deUNA PROTEINA DE FUSION GLICOSILADA por espectrometria de masaMaria Pia Valacco, Ricardo Martin Neme Tauil, German Fernandez, Alejandro Parola, Alicia Couto, Silvia Moreno.Institución: CEQUIBIEM-IQUIBICEN-FCEN-CONICET-UBAArgentina, pvalacco@qb.fcen.uba.arProteómica-Biosimilares-Glicosilación La OMS define a losbiosimilares como un producto bioterapéutico que es similar en términos decalidad, seguridad y eficacia a un producto ya presente en el mercado1.Los biosimilaresson proteínas recombinantes que han sido diseñadas para ser lo más parecidoposible a las moléculas innovadoras, porque entre otros presentan la mismasecuencia primaria, modificaciones postraduccionales similares, estructurasecundaria, terciaria y cuaternaria globalmente similares y perfiles deimpurezas que no difieren significativamente. Sin embargo para su registro esnecesario realizar una batería de comparaciones sofisticadas, no sólo a nivelfisicoquímico sino a nivel bioquímico y que incluye ensayos in vitro e in vivo y ensayos clínicos. Cuando estos ensayos se realizan demanera comparativa constituyen un ejercicio de comparabilidad entre uninnovador y un biosimilar.El innovador encuestión es una proteína recombinante producida en células CHO. Se trata de unamolécula de alto PM, con estructura compleja con más de 15 puentes disulfuro, ymúltiples glicosilaciones de tipo N y O. Se desea determinar y verificar susecuencia primaria, la presencia de los puentes disulfuro esperados, y lasglicosilacionesUtilizandoherramientas de espectrometría de masa MALDI TOF TOF y Orbitrap Se realizó lacaracterización de la proteína en cuanto a su masa molecular, secuenciaaminoacídica y modificaciones postraduccionalesPara ladeterminación de masa molecular de la proteína intacta se utilizó elespectrómetro de Masa MALDI TOF TOF (Bruker Daltonics), y se verificó quecoincide con la masa molecular teórica.La proteína fuedeglicosilada con la enzima PNGasa que corta los enlaces N-glicosidicos, yluego con una O-glicanasa. Para el mapeo peptídico, que pretende cubrir lamayor parte de la secuencia por MS y MSMS, se realizaron digestiones enzimáticascon varias proteasas de sitio de corte específico (Tripsina, corta a la derechade lisina y arginina; Quimotripsina, corta a la derecha de triptofano, metionina,fenilalanina, tirosina, leucina; Gluc-c, corta a la derecha de glutámico) yanálisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y connanoHPLC, acoplada a Q Exactive para lograr cobertura total de la secuencia conlos péptidos identificados.Se logró unacobertura de aproximadamente un 86,3% por MS y MSMSTambién serealizaron digestiones de la molécula sin deglicosilar, con las mismasproteasas, para luego realizar un enriquecimiento en glicopeptidos por HILIC yasi identificar sitios de glicosilación y poder estudiar la composición de losdiferentes glicanos unidos.Luego se realizó laconstrucción de la base de datos de glicanos, para poder realizar la búsquedaautomática de los mismos, con el software Proteome Discoverer.Se identificaronvarios sitios de glicosilación esperados y otros no descriptos hasta elmomento.