Utilización de un fosfopéptido como ligando de afinidad para la purificación de PLA2 presente en el veneno de Crotalus durissus terrificus

SAAVEDRA, SOLEDAD L.; G. ACOSTA; L ÁVILA; S. L. GIUDICESSI; S.A. CAMPERI; F. ALBERICIO; O. CASCONE; M. C. MARTÍNEZ CERON

CABA

Congreso; XXI Congreso Argentino de Toxicología; 2019

ATA

Se ha propuesto usar fosfolipasa A2 (PLA2) presente en el veneno de la serpiente Crotalus durissus terrificus (Cdt) como posible agente antiviral (dengue, fiebre amarilla). La PLA2 se encuentra formando un complejo con la crotapotina (Ctp), la cual actúa como chaperona acompañándola hasta el sitio de acción. Dicho complejo, llamado crotoxina representa, aproximadamente, el 50 % del peso seco del veneno.Se propone diseñar un método de purificación de PLA2 factible de ser escalado a nivel industrial. Los péptidos han demostrado ser ligandos de afinidad de gran utilidad para la purificación de numerosas moléculas porque pueden ser sintetizados a bajo costo y bajo normas GMP. Se diseñó un fosfopéptido (P-Lys) con una fosfoserina en su secuencia y colas no polares para emular la estructura de un fosfolípido. La síntesis del mismo se realizó en fase sólida sobre bolillas de Rink-Amide utilizando Fmoc aminoácidos. Luego, se lo inmovilizó en NHS-Sepharose para ser utilizado como matriz cromatográfica. Se optimizaron las condiciones del proceso y se evalúo su desempeño utilizando geles SDS-PAGE 15% y SDS-PAGE-tricina. También se determinó la concentración de proteínas y la actividad de la enzima en la muestra original, lavado y eluidos por el método de Bradford y del reactivo ácido 4-nitro-3-(octanoiloxi)benzoico (4N3OBA) respectivamente. Para las cromatografías se trabajó con una siembra de 100 µl del veneno (150 mg/ml) en una dilución 1/20 en el buffer de adsorción. Las mejores condiciones para la purificación de PLA2 a partir de veneno, a un flujo de 0.25 ml/min, fueron: Adsorción: buffer Tris/HCl 10 mM pH 8.0, CaCl2 10 mM, NaCl 100 mM. Elución 1: buffer Acetato de Na/Ác. Acético 100 mM, NaCl 500 mM, EDTA 25 mM pH 4.5.Elución 2: NaOH 50 mM.El porcentaje de adsorción alcanzó el 70% y al realizar los geles se observaron varias bandas, una de bajo PM en el eluido 1 y tres en el eluido 2, de las cuales una corresponde al PM de la PLA2 (14 kDa). Las mismas fueron sometidas a digestión con tripsina y los péptidos obtenidos fueron identificados por espectrometría de masas. Así se pudo determinar que con el buffer de elución 1 se recuperó crotamina (otra proteína presente en el veneno de Cdt) y con el buffer de elución 2 la PLA2 y multímeros de ésta. Tanto el lavado como el eluido 1 no presentaron actividad enzimática significativa, lo que demuestra que en el eluido 2 realmente se recupera la enzima. El rendimiento del proceso superó el 100% y el factor de purificación fue aproximadamente de 10. A través del diseño de un fosfopéptido se logró recuperar PLA2 con una pureza adecuada a partir de una muestra de veneno de Cdt en un único paso cromatográfico. Además, se ha recuperado inesperadamente y de forma separada una segunda proteína, la crotamina, a la cual se la ha mencionado como posible agente terapéutico como anticancerígeno. Se ha descripto que la PLA2 tiene mayor actividad en su forma monomérica que en su forma acomplejada con la crotapotina.