BIBLIOTECAS COMBINATORIAS PEPTÍDICAS PARA HALLAR PÉPTIDOS BLOQUEANTES DE LA FOSFOLIPASA A2 DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS

M. C. MARTÍNEZ-CERON; L. ÁVILA; S. L. GIUDICESSI; M. FINGERMANN; S. L. SAAVEDRA; M. B. DE MARCO; J. C. DOKMETJIAN; M. BISCOGLIO; F. ALBERICIO; S. A. CAMPERI; O. CASCONE

Buenos Aires

Congreso; 8º CONGRESO Y EXPOSICIÓN PARA LA CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA, BIOTECNOLÓGICA Y VETERINARIA; 2014

ETIF

Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) o serpiente de cascabel, es la única especie del género en la Argentina. Habita zonas cálidas, tanto en climas húmedos como secos. El principal compuesto tóxico del veneno de C.d.t. es la crotoxina, la cual representa casi el 50% del veneno seco y cuya principal acción es neurotóxica. Es un heterodímero compuesto por una subunidad A (fosfolipasa A2, PLA2) y una subunidad B (crotapotina). En la actualidad el tratamiento para las mordeduras de C.d.t. es la inyección de antiveneno obtenido a partir de suero de equinos hiperinmunizados con veneno. Los péptidos cortos son estables y resistentes a la acción de proteasas. Se pueden producir a granel, a bajo costo y alta pureza bajo normas GMP en forma sintética. El desafío de su uso como antiveneno total o parcial es encontrar péptidos con suficiente afinidad por la PLA2 que permitan bloquear total o parcialmente su acción neurotóxica. Para ello se sintetizó una biblioteca combinatoria peptídica en fase sólida XXXXXGGAGG, donde X= A, E, F, H, L, N, P, R, S, T, V, Y, utilizando el método Dividir-Acoplar-Recombinar (DAR) que consiste en (i) dividir el soporte sólido (bolillas de resina) en porciones iguales, (ii) acoplar a cada porción individual un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones. Esto permite obtener péptidos con todas las combinaciones posibles de los aminoácidos y que en cada bolilla de resina sólo haya una única entidad peptídica. Para realizar el screening de afinidad a la PLA2 se puso en contacto la biblioteca con una pequeña cantidad de PLA2 purificada en nuestro laboratorio a partir de veneno de C.d.t. y previamente marcada con NHS-biotina. Para identificar aquellas bolillas que contenían péptidos con afinidad por la PLA2, se reveló con estreptavidina-peroxidasa y α-cloronaftol/H2O2. Las bolillas que adquirieron color violeta se aislaron y los péptidos se secuenciaron por MALDI-TOF MS/MS. Finalmente, se analizaron las secuencias de los péptidos para determinar la frecuencia de aparición de aminoácidos por posición y la presencia de patrones característicos. De esta manera se seleccionaron los péptidos a ser sintetizados en mayor cantidad para evaluar su capacidad bloqueante de PLA2 tanto in vitro como in vivo.