Nanopartículas magnéticas con un ligando peptídico inmovilizado para purificar bevacizumab

G. R. BARREDO VACCHELLI; J. F. O. ORLOWSKI; S. L. GIUDICESSI; S. A. CAMPERI

Buenos Aires

Workshop; Fronteras en nanobiotecnología III; 2022

FFyB. UBA

El bevacizumab, producido en células CHO, se une al factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) bloqueando su acción angiogénica, por lo que se lo aplica en el tratamientos de determinados tipos de cáncer. Actualmente, su purificación se realiza mediante cromatografía de afinidad con proteína A inmovilizada en matrices a base de partículas porosas de agarosa. El proceso requiere un paso previo de clarificación para evitar la obstrucción de la columna, la proteína A es un ligando altamente costoso y las condiciones altamente ácidas de elución dañan tanto al mAb como a la proteína A. Alternativamente, las nanopartículas magnéticas (NPM) con péptidos inmovilizados, pueden utilizarse como adsorbente alternativo para la purificación bevacizumab. Debido a su tamaño nanométrico, forman suspensiones coloidales estables y tienen una alta área superficial por unidad de volumen, lo que aumenta su capacidad de adsorción de proteínas. Se pueden mezclar directamente con la muestra sin previa clarificación. El complejo magnético se remueve fácilmente utilizando un separador magnético. Los péptidos cortos son ideales como ligandos para separaciones industriales ya que pueden sintetizarse a gran escala a bajo costo. A su vez, son mucho más estables y permiten condiciones moderadas de elución. En el presente trabajo se desarrolló una estrategia de purificación de bevacizumab basada en un ligando peptídico unido NPM.En base a estudios previos de la interacción entre bevacizumab y el VEGF-A, se evaluó por docking molecular (MD) la interacción del fragmento 85-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-Ile-Gly-92 del VEGF-A con el bevacizumab, fuera de la estructura proteica. Los estudios de MD permitieron identificar los aminoácidos involucrados en la interacción entre el péptido PHQGQHIG y bevacizumab y se hallaron modelos cuya buena performance en cuanto a la energía de afinidad demostraron su unión con bevacizumab para su aplicación como ligando de afinidad. Posteriormente se sintetizó el péptido Ac-PHQGQHIGVSK mediante síntesis en fase sólida (SPPS) utilizando la química Fmoc y se lo analizó por RP-HPLC y MALDI MS. La Lys actuó de brazo espaciador y permitió unir el péptido a NPM activadas con éster N-hidroxisuccinimidilo (NHS) a través del  amino. Las NPM con el péptido inmovilizado se añadieron a una muestra de bevacizumab de un cultivo de células CHO en microtubos. Las MNP se separaron utilizando una gradilla magnética y se eluyó la proteína adsorbida. Las muestras se evaluaron mediante SDS-PAGE, lo que demostró que los MNP pueden adsorber bevacizumab de forma selectiva.Los péptidos-MNP pueden ser útiles para la purificación de bevacizumab a partir de medios de cultivo sin clarificación previa y además, para facilitar la toma de muestras para el control de calidad durante el proceso de producción.