Control de calidad en la síntesis de inmunógenos para el desarrollo de antivenenos de arácnidos

JA RODRIGUEZ; LC IGLESIAS GARCÍA; GR BARREDO VACCHELLI; SA CAMPERI

San Luis

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

SAEM

Los envenenamientos producidos por arácnidos constituyen una emergencia tratable con antídotos adecuados. Actualmente, se producen sueros contra los principales arácnidos de importancia médica, sin embargo, para su producción es necesario capturar a los pequeños animales y extraerles el veneno, proceso engorroso y de bajo rendimiento. Luego, el veneno es inyectado en caballos para la producción de los anticuerpos protectores contra el envenenamiento. Teniendo en cuenta las principales toxinas responsables de los síntomas de envenenamiento por la araña Phoneutria nigriventer y el escorpión Tityus trivittatus hemos diseñado y sintetizado péptidos inmunogénicos conformados con los epitopes de las principales toxinas para ser luego utilizados en la producción de los sueros antivenenos. Para incrementar su inmunogenicidad se agregó ácido palmítico al extremo N terminal de los péptidos sintetizados y/o se los ramificó. Para esto último, se utilizó la Lys que permitió acoplar los siguientes aminoácidos a partir tanto del  como del  amino.Los péptidos diseñados se sintetizaron por síntesis en fase sólida utilizando la química Fmoc/tBu y la resina Rink Amide MBHA. Luego de los acoples de los aminoácidos protegidos, se eliminaron los grupos protectores de cadenas laterales con cocktail de trifluoracético (TFA). Los péptidos se recuperaron por precipitación y se liofilizaron para su posterior análisis por RP HPLC con una columna columna XSelect C18 3,5μm, 4,6x50mm a 50ºC utilizando un gradiente agua/acetonitrilo (MeCN) con los solventes: A) 0,045% de TFA en agua miliQ y b) 0,036% TFA en MeCN. Posteriormente, los péptidos se analizaron por espectrometría de masas (MS) por inyección directa en un Thermo Scientific, (modelo Q-Exactive) en el CEQUIBIEM, FCEyN, UBA. La ionización de las muestras se realizó por electrospray (ESI) con un voltaje de 2,5 a 3,5kV.A partir de los cromatogramas se pudo demostrar una alta pureza de los péptidos lineales y palmitoilados sintetizados, tanto los correspondientes a Tityus como a Phoneutria. Eso hizo sospechar de la presencia de impurezas en el producto ramificado. En un principio, se sospechó que la incorporación del ácido palmítico podría haber sido incompleta. Sin embargo, cuando se analizaron los ESI MS en todos los casos los picos obtenidos correspondieron a la relación m/z del ion de los lipopéptidos sintetizados con la presencia de uno o más H+ y/o Na+ de masa monoisotópicas 4501,64u y 4294,31u para el péptido de Phoneutria y Tityus, respectivamente. Se sospecha que la presencia de más de un pico en el cromatograma de los lipopéptidos ramificados podría deberse a la existencia de dos conformaciones en equilibrio a una velocidad de interconversión lo suficientemente lenta como para detectarse en el cromatograma como dos especies distintas debido a la diferencia en la hidrofobicidad entre las conformaciones.En un futuro los lipopéptidos diseñados serán ensayados para su aplicación como inmunógenos para la generación de anticuerpos neutralizantes en el proceso de elaboración de antivenenos.