INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Análisis del proceso de purificación de bevacizumab con el ligando Ac-PHQGQHIGVSK-NH2 inmovilizado por mapeo peptídico
Autor/es:
GR BARREDO VACCHELLI; SL GIUDICESSI; SA CAMPERI
Lugar:
San Luis
Reunión:
Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022
Institución organizadora:
SAEM
Resumen:
El anticuerpo monoclonal (mAb) terapéutico bevacizumab, utilizado en el tratamiento de variostipos de cáncer, es producido por cultivo en biorreactores en células de hámster chino (CHO)recombinantes. Tradicionalmente, su purificación a partir del caldo de cultivo celular se realiza porcromatografía de afinidad con proteína A inmovilizada. El alto costo y labilidad de la proteína Asumado a las condiciones extremas para la elución del mAb, promovieron el desarrollo de unligando alternativo para su purificación. Recientemente, hemos diseñado soportes conPHQGQHIGVSK-NH 2 inmovilizado capaces de purificar bevacizumab a partir de un caldo decultivo celular de una manera más económica y bajo condiciones más suaves. En el presentetrabajo, se llevó a cabo el proceso de purificación diseñado, a partir de muestras crudas debevacizumab donadas por la planta de producción mAbxience. Posteriormente, se realizó elcontrol de calidad de la muestra purificada por mapeo peptídico en el CEQUIBIEM, FCEyN, UBA,de manera de analizar la presencia de contaminantes provenientes del proceso de produccióntanto como del producto (bevacizumab).Se realizó un SDS-PAGE bajo condiciones reductoras de la muestra proteica, y se reveló conCoomasie Coloidal. Cada banda se cortó con bisturí y se digirió con tripsina. La mezcla depéptidos de cada banda se analizó por RP-HPLC acoplado a un ESI MS (Thermo Scientific,modelo Q-Exactive) de manera de identificar cada péptido por MS y MS/MS. Los espectros MS yMS/MS obtenidos fueron analizados con el programa Proteome Discoverer (marca ThermoScientific versión 1.4) usando la base de datos de Uniprot para bevacizumab y para Crisetulusgriseus de manera de poder detectar impurezas tanto provenientes del huésped (células CHO)como de productos de degradación del mAb.En el SDS-PAGE se obtuvo una banda de ≈50 kDa, otra de ≈25 kDa y una tercera banda de ≈30kDa que se encontraba en mucha menor concentración y que pudo verse gracias a la mayorsensibilidad del Coomasie coloidal. A partir del análisis por MS y MS/MS de los péptidosprovenientes de la digestión con tripsina, se identificó la cadena pesada de bevacizumab (en labanda de ≈50 kDa) y su cadena liviana (en la banda de ≈25 kDa) con un porcentaje de coberturadel 80% y 97% y un score Sequest HT de 1521 y 1147, respectivamente. Por otro lado, seobservó que la banda de ≈30 kDa correspondía a un producto de degradación del mAb y no a unaproteína proveniente de células CHO. El mayor score se encontró para la cadena pesada debevacizumab. Cuando se analizaron las secuencias peptídicas halladas, éstas correspondían alextremo N terminal de la cadena, abarcando los dominios VH, CH1 y parte del CH2. El porcentajede cobertura en dicha región es alto. Por otro lado, no se encontraron péptidos correspondientesal extremo C terminal de la cadena. Esto se puede deber a que el ligando Ac-PHQGQHIGVSK seune a la región variable del mAb, pudiéndose así adsorber a la columna aquellos fragmentos delmAb que conserven dicha región. La presencia de productos de degradación de los mAb ha sidomuy estudiada y son originados principalmente por la acción de proteasas del huésped. Si bienson más abundantes cuando se almacenan muestras crudas proveniente de un cultivo, tambiénse han reportado degradaciones debidas a proteasas residuales en los mAb purificados.El control de calidad demostró la alta selectividad del ligando por la región variable del mAb, noencontrándose contaminada la muestra por proteínas provenientes del huésped.