Control de calidad de péptidos antimicrobianos por ESI MS para el tratamiento de hongos multirresistentes intrahospitalarios

SL GIUDICESSI; R VITALE; SA CAMPERI

San Luis

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

SAEM

Los péptidos antimicrobianos (AMP) han adquirido importancia en su función como agentes antimicrobianos dado el incremento de la resistencia de diferentes patógenos. Han surgido nuevas cepas y existen hongos resistentes a los fármacos más comúnmente utilizados, lo que hace necesario el desarrollo de antifúngicos más eficientes. Por otro lado, el grado de pureza es un factor clave en el desarrollo de los nuevos antifúngicos, debido a que muchos de éstos deben ser administrados por vía oral o intravenosa. En este trabajo se sinterizaron tres AMP (TB, MP Y CHN) y se realizó por espectrometría de masas de ionización por electroespray (ESI MS) el control de calidad de los mismos para ser probados como potenciales agentes antifúngicos contra cepas clínicas del género Candida, obtenidas a partir de muestras de pacientes hospitalizados.Los AMP se sintetizaron empleando la química en fase sólida Fmoc/tBu en resina Rink-Amide-metilbenzhidrilamina (MBHA) según Jaradat (2018). El control de calidad de los péptidos se realizó en el CEQUIBIEM, FCEyN, UBA, por nanoHPLC con columna de fase reversa C18 acoplado a un ESI MS (ThermoScientific, modelo Q-Exactive) de manera de identificar cada péptido por MS y MS/MS. Los espectros MS y MS/MS obtenidos fueron analizados con el programa Proteome Discoverer. La metodología biológica se realizó según guías internacionales de concentración inhibitoria mínima por microdilución según the Clinical Laboratory Standard Institute (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2008). Se tomaron colonias crecidas en medio Saboureaud y se preparó un inóculo 1 Mc Farland. Se prepararon placas de Petri con medio Mueller Hinton y se sembró el inóculo con cada cepa a ensayar, haciendo orificios con sacabocado en el que se inocularon 30 µl de cuatro concentraciones de cada péptido (5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml y 0,512 mg/ml). Se incubaron las placas por 24-48 horas a 37°C.En los espectros de masa se observaron los iones mono y policargados de los tres péptidos con una alta pureza y resolución. Para confirmar si los péptidos habían sido correctamente sintetizados, se realizó también un análisis por MS/MS en el que obtuvieron los espectros con las señales correspondientes a las series" b" e "y" de cada AMP. Una vez confirmada la pureza de cada AMP, se procedió al estudio de inhibición. Los tres AMP presentaron actividad antifúngica contra la especie C. tropicalis, de la cual no se encontraron registros previos en bibliografía, a la concentración de 1,25 mg/ml para TB y MP, y 5 mg/ml para CHN. Para C. glabrata, se observó actividad antifúngica a una concentración de 5 mg/ml para MP. Los péptidos TB, MP Y CHN demostraron ser una alternativa promisoria en la búsqueda de una nueva clase de antifúngicos, ya que los péptidos cortos presentan varias ventajas como ser su fácil síntesis bajo normas GMP, su alta estabilidad, reproducibilidad y bajo costo de producción. Jaradat, D.M.M. (2018). Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation. Amino Acids, 50(1), 39-68. National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003). Reference method for broth dilution susceptibility testing of yeasts: approved standard. M27-A2.National Committee for Clinical Laboratory Standards (2008). Reference method for broth dilution susceptibility testing of filamentous fungi: approved standard. M38-A2.