INVESTIGADORES
BRECCIA Javier Dario
congresos y reuniones científicas
Título:
Sistema de desglicosilación enzimática de rutina del hongo Acremonium sp. DSM69247
Autor/es:
WEIZ G; BRAUN LE; NEHER B; MAZZAFERRO L; BRECCIA JD
Reunión:
Simposio; 3er Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014
Resumen:
SISTEMA DE DESGLICOSILACIÓN ENZIMÁTICA DE RUTINA DEL HONGO Acremonium sp. DSM69247. Weiz, Gisela; Braun, Lucas E.; Neher, Barbara D.; Mazzaferro Laura S. & Breccia Javier D. INCITAP-CONICET, Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de La Pampa (UNLPam), Av. Uruguay 151, (6300) Santa Rosa, La Pampa, Argentina. INTRODUCCIÓN Rutina ( ) es un flavonoide abundante en alimentos como trigo sarraceno, cítricos, té negro, cáscaras de manzana, cebollas, uvas, avena, etc. Su aglicona quercetina tiene mayor actividad antioxidante que el diglicósido rutina, exhibiendo además propiedades antialergénicas, antiproliferativa y antibacteriana. En 1999, la Agencia Internacional para Investigación en Cáncer (International Agency for Research on Cancer, IARC) concluyó que quercetina es un potencial agente anticancerígeno. Su producción depende en gran parte del proceso de remoción de la fracción glicosídica, ya sea por vía química o enzimática. Las ?diglicosidasas? son enzimas que liberan dicha fracción en un solo paso, sin embargo estas no son tan frecuentes en la naturaleza. MATERIALES Y MÉTODOS - Medio de Cultivo de Acremonium sp. DSM 24697 (g/l): 5.0 rutina, 1.0 peptona, 2.0 extracto de levadura, 100 mM buffer citrato de sodio pH 5. - Ensayos enzimáticos: se incubó 450 μl de rutina (0.11%p/v en 50 mM buffer citrato de sodio pH 5.0) con 50 μl de muestra (1h, 40°C). Monoglicosidasas: se incubó 0.35 mM p-nitro-derivados de ramnosa o glucosa (895 μl) en buffer citrato de sodio pH 5.0 con 30 μl de muestra (1h, 40°C). Una unidad corresponde a la cantidad de enzima que libera 1µmol de sustrato/min. RESULTADOS La actividad rutinosidasa en cultivo sumergido (25°C, pH 5) fue máxima luego de 4 días (14 U/L). El análisis zimográfico del caldo de cultivo mostró una banda de actividad frente al sustrato 4-metilumbeliferil-rutinósido con un Rf de 0.13. Los productos de la hidrólisis de rutina fueron rutinosa y la aglicona quercetina. La actividad enzimática frente a los sustratos sintéticos monoglicosilados (p-nitrofenilramnósido y p-nitrofenilglucósido) respecto del sustrato diglicosilado (p-nitrofenil rutinósido) fue entre 800-1500 veces menor respectivamente. Estos resultados sugieren que la actividad diglicosidasa es el principal mecanismo de desglicosilación de la rutina (Fig. 1). El perfil de actividad de la enzima mostró un máximo a pH 6.5 y mantuvo >50% en el rango de pH 2.5 ? 9.5. La temperatura óptima aparente fue de 50 ºC (1h, pH 6.5); mantuvo el 65% de la actividad hasta los 60ºC, mientras que a 70 ºC no se detectó actividad. Cuando el extracto fue incubado a diferentes temperaturas en ausencia de sustrato, la actividad residual decreció abruptamente desde los 50ºC. CONCLUSIONES Acremonium sp. DSM 24697 fue capaz de producir actividad desglicosilante de rutina. Este proceso se produjo mayormente en un único paso, mediante hidrólisis del enlace heterosídico entre rutinosa-quercetina. Las actividades monoglicosidasas fueron despreciables, indicando que la diglicosidasa es el principal mecanismo en el inicio de la degradación del flavonoide. La actividad se mantuvo hasta los 65°C y es probable que el sustrato favorezca su estabilidad.