Neurotoxina botulínica tipo A: parámetros de control durante el proceso de purificación

CABALLERO PA, SOSA M, DE JONG LIT, CICCARELLI AS, BIANCO MI, DEGARBO SM, SAGUA MD, FERNÁNDEZ RA

Bahía Blanca, Buenos Aires, Argentina

Jornada; XI Jornadas Argentinas de Microbiología. II Jornadas de Microbiología e Infectología del Sur Argentino.; 2005

La neurotoxina botulínica (NTBo) tipo A sintetizada como una cadena simple de 150-kDa se encuentra asociada a componentes no tóxicos (hemaglutinantes y no hemaglutinantes), dando lugar a tres complejos multiproteicos, LL, L y M, de 900, 500 y 300 kDa. La NTBo bloquea la liberación de acetilcolina en la placa mioneural produciendo parálisis fláccida. Su administración intramuscular produce parálisis localizada, con atrofia temporal del  músculo hasta el restablecimiento de la función normal por rebrote neuronal. Actualmente, se utiliza con éxito en el tratamiento de un número elevado de patologías como: hiperhidrosis, y desórdenes de la tonicidad muscular (estrabismo, blefaroespasmo, tortícolis espasmódica, distonías, espasmo hemifacial, etc.). También se aplica en la terapéutica del dolor y como herramienta para estudios en biología molecular y celular. A partir de la cepa de Clostridium botulinum prototipo A-Hall, se produjo NTBo en medio con diálisis en saco de celofán. Durante la purificación por precipitación ácida se determinó: 1) la actividad específica (relación toxicidad por mg de nitrógeno porteico) en las diferentes etapas, y 2) integridad molecular mediante la capacidad hemaglutinante de eritrocitos humanos y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La toxicidad se estimó en DL50/ml por el método de Reed y Muench. La concentración de nitrógeno proteico se determinó por el método de Lowry. La purificación se realizó por precipitación ácida-alcohólica (Duff y col.). Se partió de toxina con una actividad de 4,49 x 105 DL50/ml. La actividad específica en las distintas etapas de purificación fue 1,20 x 105 DL50/mg N en la primera, 1,03 x 106 DL50/mg de N en la segunda y 2,00 x 108 DL50/mg de N en la tercera. El título hemaglutinante resultó: 1:8.195 en la primera; 1:131.138 en la segunda y 1:64 en la tercera.   Los resultados muestran un aumento considerable en la actividad tóxica durante el proceso: 8,6 veces entre la primera y segunda etapa y 194,2 veces entre la segunda y tercera (total: 1.666,7). La electroforesis en gel de poliacrilamida permitió determinar que la NTBo se encontraba pura, ya que no se observó presencia de bandas extrañas o contaminantes. En los productos obtenidos, en todas las etapas se observó actividad hemaglutinante con variaciones importantes en los títulos, por lo que sería conveniente considerar estudios futuros para relacionar este parámetro con la integridad molecular.