INVESTIGADORES
BELAUNZARAN maria Laura
congresos y reuniones científicas
Título:
Clonado y expresión de Fosfolipasa A1 de Leishmaniabraziliensis en un sistema de expresión de baculovirus
Autor/es:
BOTT, EMANUEL; LOPEZ, MARIA GABRIELA; GIMÉNEZ, GUADALUPE; LAMMEL, ESTELA MARÍA; DURANTE DE ISOLA, ELVIRA LUISA; TABOGA, OSCAR; BELAUNZARÁN, MARIA LAURA
Lugar:
Ciudad Autonoma de Buenos Aires
Reunión:
Otro; XXVII Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Protozoologia; 2015
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoologia
Resumen:
Resultados de nuestro laboratorio sugieren un papel fisiológico importante para las fosfolipasasA1 (PLA1) de tripanosomátidos, particularmente en los estadios del mamífero, que podría contribuir a la patogénesis de las enfermedades causadas por estos patógenos. EnLeishmaniabraziliensisdetectamospreviamentela presencia de actividad PLA1, realizando luego la búsqueda de genes putativosen TriTrypDBy seleccionando elgen LbrM.31.2750 para su clonado y expresión en E. coli. Laproteína recombinante obtenida fuereconocida por suero anti-PLA1 pero no presentóactividad enzimática (Belaunzarány col. 2011). En el presentetrabajo clonamos y expresamos dicho gen en el sistema baculovirus-células de insectoBac-tobac. La secuencia codificante para PLA1se amplificó por PCR desde ADN genómico de promastigotes de L. braziliensis obteniendo un producto de 1122pb que fue clonado en pCR2.1TOPO y sub-clonado en pFastBac HTB®. Los plásmidos que incorporaron el inserto se usaron para transformar bacterias DH10Bac y generar portransposición bácmidos recombinantes con los quese transfectaron células de insecto Sf9. El sobrenadante conteniendo los baculovirus recombinantes se cosechó a los 5 días y luego de 2 pasajes en células se titularonlos stocks virales. Se infectaron células Sf9 a una MOI=1 y se cosecharon a las 24, 48 y 72 hs.El análisis por inmunoblot y los ensayos de actividad enzimática de los lisados celulares mostraron que, si bien los niveles de expresión fueron bajos, ésta alcanzó su valor máximo 72 hspost infección.La proteína expresada fue reconocidapor el anticuerpo anti-Histidina,conun PM similar al de la enzima nativa de ~50 kDa, siendo capaz de hidrolizar fosfatidilcolina con generación de lisofosfatidilcolina,confirmando así que la misma posee actividad PLA1, la cual fue óptima a pH ~5. La secuencia correspondiente fue depositada en GenBankTM, número de acceso KJ957826. Financiado por Conicet.