Detección y caracterización de Fosfolipasas A de Leishmania braziliensis

BELAUNZARÁN, ML; LAMMEL, EM; GIMÉNEZ, G; BOTT, EMANUEL; ISOLA, ELD

Bogotá

Congreso; XX Congreso Latinoamericano de Parasitologia y XV Congreso Colombiano de Parasitologia y Medicina Tropical.; 2011

Federación Latinoamericana de Parasitologia (FLAP)

Detección y caracterización de Fosfolipasas A de Leishmania braziliensis. María Laura Belaunzarán, Estela María Lammel, Guadalupe Giménez, Emanuel Bott, Elvira LD de Isola. Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires. Argentina.   Introducción: Previamente caracterizamos la actividad Fosfolipasa A1 (PLA1) de Trypanosoma cruzi, siendo en estadíos infectivos significativamente mayor, asociada a membrana y secretada. PLA1 genera segundos mensajeros lipídicos en la célula huésped y participa en eventos de señalización que preceden la invasión parasitaria. En el presente trabajo estudiaremos las actividades PLA en Leishmania braziliensis, tripanosomátido de importancia médica. Materiales y métodos: Parásitos: Promastigotes de L. braziliensis, clon MHOM/BR/75M2904. Sobrenadantes de cultivo: Para evaluar PLA secretada, se incubaron promastigotes en RPMI+5%SFB, 1h 37ºC y centrifugaron. Alícuotas de los sobrenadantes se filtraron (100000 kDa) y almacenaron a -80ºC +inhibidores de proteasas. Homogenatos parasitarios: Los parásitos se congelaron/descongelaron en N2 líquido, +inhibidores de proteasas, centrifugaron y almacenaron a -80ºC. Anticuerpos anti-PLA1: Se inmunizaron ratones BalbC, vía intramuscula,r con 10 g/ml enzima/ratón. Como antígenos se emplearon PLA1 purificada de T. cruzi y PLA1 recombinante de T. brucei. Actividad PLA: Alícuotas de homogenatos parasitarios y sobrenadantes de cultivo se incubaron con 1-palmitoil-2-[1-14C]oleoilfosfatidilcolina, 1h, 37°C. Los lípidos se extrajeron por Bligh&Dyer, separaron por cromatografía en capa delgada y se evaluó por autorradiografia la generación de lisofosfatidilcolina (actividad PLA1) y ácidos grasos libres (actividad PLA2). Expresión de PLA: Se determinó por Inmunoblot, en homogenatos parasitarios y sobrenadantes de cultivo utilizando anticuerpos anti-PLA1. Resultados: Se determinó en homogenatos de promastigotes de L. braziliensis, la generación de lisofosfatidilcolina y de ácidos grasos libres, indicativos de actividades PLA1 y PLA2 respectivamente, sobre fosfatidilcolina. Se reconocieron por Inmunoblot dos bandas de aproximadamente 40-50 kDa en homogenatos de promastigotes de L. braziliensis, empleando anticuerpos anti-PLA1 de T. cruzi y de T. brucei. Se evaluó además la secreción de PLA en sobrenadantes de cultivo de promastigotes. Conclusiones: Se detectópor primera vez actividad PLA1 en promastigotes de L .braziliensis. Este hallazgo podría proveer nuevos blancos terapéuticos para el diseño racional de estrategias profilácticas y/o quimioterapeúticas. Financiado por CONICET/ UBA/ FONCYT