OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE TRANSGÉNESIS: REGENERACIÓN “IN VITRO” DE BROTES DE LIMONERO (Citrus limon cv. Eureka Frost. Nuclear).

SENDÍN L., DÍAZ E., VELLICCE G., MARANO M. R., GARCÍA M.L., VOJNOV A. Y CASTAGNARO A.

Tafí del Valle, Tucumán

Jornada; XXIII Jornadas Científicas. Asociación de Biología de Tucumán; 2006

Asociación de Biología de Tucumán

La transformación genética ha sido lograda para varios genotipos de cítricos (Peña et al., 2003). Sin embargo la eficiencia de transformación es baja y algunas especies permanecen recalcitrantes como por ejemplo limonero Eureka que es uno de los cultivares más importantes en la provincia de Tucumán. La producción de plantas transgénicas involucra dos procesos críticos: una integración estable del ADN foráneo en el genoma del hospedante y la subsiguiente regeneración de plantas enteras a partir de células transformadas. La primera limitante en la transformación de las especies recalcitrantes es lograr las condiciones adecuadas para aumentar su frecuencia de regeneración. El objetivo de este trabajo fue optimizar un protocolo de regeneración para limonero Eureka con el fin de expresar posteriormente de forma transgénica diferentes genes de interés agronómico. Como fuente de explantos se utilizaron plántulas de limonero Eureka germinadas “in vitro” de 6 semanas de edad. Se evaluaron dos medios de co-cultivo: A) sales MS (Murashige and Skoog, 1962), vitaminas White, sacarosa 3%, 2mg/l ácido indol acético (AIA), 2mg/l ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/l 2-isopentenil- adenina (2iP), 8 g/l agar, pH 5,7 (Ghorbel et al., 2001). B) Contiene la mitad de las concentraciones de hormonas descriptas en A, el resto de la formulación es la misma. Los epicótiles se cortaron en segmentos de 1,5 cm de longitud y se colocaron en los medios de co-cultivo A y B durante 72 hs. a baja intensidad de luz y 26ºC. Transcurrido este período los explantos se transfirieron a dos medios de regeneración: 1) sales MS, vitaminas White, sacarosa 3%, 1 mg/l bencilaminopurina (BAP), 10 g/l agar, pH 5,7. 2) Formulado de la misma manera que el medio 1 pero con 2 mg/l BAP. Los segmentos se mantuvieron en la oscuridad a 26ºC hasta la formación de callo (2 a 4 semanas) y posteriormente se sometieron a un fotoperíodo de 16 hs. Se realizó un estudio histológico de los brotes que regeneraron siguiendo procedimientos estándares (Jensen, 1962). Luego de 60 días de cultivo se evaluó la respuesta del material vegetal sometido a los diferentes tratamientos y se calculó la eficiencia de regeneración. Los resultados obtenidos se muestran en el cuadro 1. Cuadro 1. Eficiencia de regeneración de limonero Eureka  Tratamiento Medio de Co-cultivo Medio de Regeneración % de explantos que regeneraron Promedio de brotes/explanto 1 A 1 34,33 % 1,40 2 A 2 12,50 % 3,00 3 B 1 23,00 % 1,30 4 B 2 13,60 % 3,00 El tratamiento con mejor respuesta fue el tratamiento 1 donde no solo se observó un mejor aspecto del material vegetal (menor oxidación y mayor formación de callos) sino que además se obtuvo un 32% de explantos que regeneraron brotes. Este es un valor elevado teniendo en cuenta que limonero Eureka permanecía recalcitrante a la regeneración hasta el momento lo cual impedía el avance de la transformación genética en este cultiva.