INVESTIGADORES
CASTAGNARO Atilio Pedro
capítulos de libros
Título:
Herramientas moleculares para el mejoramiento genético de la resistencia a enfermedades en poroto.
Autor/es:
GALVÁN, M; RACEDO, J; MAMANÍ, A; PLOPER, DL; VIZGARRA, O; CASTAGNARO, AP
Libro:
Manual Técnico del cultivo del poroto para el noroeste argentino
Editorial:
Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres
Referencias:
Año: 2016; p. 221 - 231
Resumen:
La heterogeneidad agroecológica de las zonas donde se cultiva el poroto en la Argentina, el predominio del monocultivo y la estrecha base genética de los cultivares comerciales, condicionan el estado sanitario de este cultivo, lo que conlleva a la incidencia de múltiples plagas y enfermedades, que interfieren con su desarrollo y frecuentemente pueden afectar la productividad agronómica del mismo. La utilización de agroquímicos de síntesis para el manejo de esta problemática fitosanitaria, además de encarecer la producción, es perjudicial para la salud humana y ambiental. Por lo tanto, la incorporación de resistencia genética es una herramienta importante para aumentar la producción en el marco de un desarrollo agropecuario más sostenible.La estrategia para el mejoramiento genético convencional del poroto consiste en la generación de diversidad genética seleccionable a partir de cruzamientos biparentales, con progenitores que pueden o no tener distinto grado de domesticación, pero la condición esencial y excluyente es que dejen descendencia viable y fértil. La selección empieza a hacerse desde la F2 hasta llegar, por distinta vías, a líneas homocigotas endocriadas (F6 o más) con características mejoradas respecto de sus progenitores. En ese sentido, los avances en la genética molecular de plantas y en las técnicas de transferencia de genes representan nuevas herramientas poderosas para hacer más eficiente el mejoramiento genético del poroto, al igual que ocurre en otros cultivos. En relación a la transformación genética, ésta ofrece la posibilidad de introducir genes de interés en variedades comerciales y de este modo, mejorar, por ejemplo, el comportamiento de la planta frente a estrés de origen biótico y abiótico. De esta manera, en 2011, Brasil anunció la aprobación para el uso comercial de un poroto transgénico resistente al virus del mosaico dorado, obtenido después de más de 10 años de investigación y desarrollo tecnológico (Tollefson, 2011). Es importante tener en cuenta que un incremento en la resistencia a diferentes tipos de estrés, disminuye también las pérdidas de rendimiento que éstos pueden conllevar.Las nuevas herramientas generadas a partir de estudios de biología molecular que desembocaron en la genómica, tales como los marcadores moleculares, pueden incrementar la eficiencia y precisión en la selección de genotipos superiores para el mejoramiento de los cultivos. Un marcador molecular es un segmento de ADN (ácido desoxirribonucleico) con una ubicación específica en un cromosoma cuya herencia puede seguirse en individuos de una población y a través de generaciones. Es importante destacar que un marcador molecular puede corresponder a regiones codificantes (genes) o no codificantes (sin función conocida) del genoma de un individuo o genotipo. En términos generales, la utilidad de los marcadores moleculares para asistir a los programas de mejoramiento es muy amplia, porque por ejemplo, constituyen herramientas poderosas para caracterizar y determinar diversidad genética y a partir de esta información diseñar los mejores cruzamientos; también permiten diferenciar e identificar inequívocamente a individuos, lo que resulta valioso para la protección intelectual de variedades; y quizás lo más importante, es que los marcadores moleculares pueden ser asociados con características de interés agronómico y de herencia con distinto grado de complejidad como alto rendimiento (en cantidad y calidad), resistencia a sequía y a enfermedades, entre otras, mediante procedimientos de ?mapeo?. A partir de los estudios de mapeo de genes o QTLs (Quantitative Trait Loci: genes o regiones genómicas implicadas en caracteres cuantitativos, como rendimiento) con marcadores moleculares, se obtienen mapas genéticos de ligamiento, que son una representación de la disposición relativa de diferentes marcadores en los cromosomas, lo cual permite conocer su posición y su relación con otros marcadores y genes. Es así, que cuando un marcador se encuentra muy cercano (altamente ligado) a un gen de interés, éste resulta muy útil para ser empleado en selección asistida en los programas de mejoramiento, sin la necesidad de tener que medir o fenotipar la expresión o efecto de ese gen o región del cromosoma. La selección asistida por marcadores moleculares (MAS- marker assisted selection) se basa en la selección indirecta de un gen que codifica para un carácter de interés agronómico a partir de la selección del marcador ligado a dicho gen. Es decir, que permite identificar o seleccionar indirectamente plantas portadoras de determinados caracteres a partir de la información proporcionada por los marcadores. Quizás la mayor ventaja que presenta la MAS sobre la selección convencional es que la selección se basa en el ADN de los individuos independizándose del efecto del ambiente, por lo tanto la evaluación de los caracteres y la selección de individuos puede hacerse en etapas tempranas del desarrollo, por ejemplo en estadío de plantas pequeñas y como se dijo antes, sin la necesidad de medir la expresión o el efecto fenotípico: esto significa que por un lado, no es necesario reproducir la condiciones de estrés para identificar a un individuo superior (con el consiguiente ahorro económico) y por otra parte, que cambios indetectables e inmanejables del ambiente no enmascaran el potencial genético del individuo. Todo lo cual trae como consecuencia que al ser la selección mucho más efectiva, es posible obtener mayor cantidad de variedades en menor tiempo por reducción del número de generaciones de selección en los programas de mejoramiento genético.En los últimos años la comunidad Phaseomics (Phaseolus Genomics), integrada por grupos de investigación de renombre internacional, ha obtenido sólidos avances en genómica de poroto a partir del desarrollo de marcadores ligados a diferentes genes o QTLs implicados en la resistencia a estrés de origen biótico y abiótico. Los marcadores moleculares fueron utilizados para asistir a los programas de mejoramiento de poroto de diferentes maneras, incluyendo estudios sobre el origen y diversidad de cultivares, domesticación y el control genético de la resistencia a enfermedades (Gepts, 1998; Koinange et al., 1996; Miklas et al., 2003; Miklas et al., 2006; Nodari et al., 1993; Yu et al., 1998). El primer mapa de ligamiento del poroto común se desarrolló empleando marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Adam-Blondon et al., 1994). Otros tipos de marcadores como los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) y microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats) se utilizaron para aumentar la densidad del mapa consenso (Blair et al., 2003; Yu et al., 2000). Recientemente, marcadores funcionales asociados a genes de resistencia conocidos, como los SSR-EST (SSR-Expressed Sequence Tag), RGAs (Resistance Gene Analogs), SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) y DArT (Diversity array technology), fueron incorporados al mapa (Hanai et al., 2010). El desarrollo de mapas saturados con gran cantidad de marcadores ampliamente distribuidos en el genoma, junto con los resultados de la reciente publicación de la secuencia del genoma del poroto (Schmutz et al., 2014), proveen una base fundamental para hacer más eficientes los programas de mejoramiento mediante MAS. Por ejemplo, facilitan el monitoreo de las retrocruzas permitiendo una recuperación más rápida y eficiente del genoma del progenitor recurrente, minimizando el efecto producido por el arrastre de genes indeseables. Por otro lado, hacen posible el etiquetado de genes (gene tagging) para ser utilizados en la selección asistida por marcadores, lo que comprende tanto la identificación de marcadores fuertemente ligados a genes de resistencia a diferentes enfermedades, como a genes que codifican para caracteres cuantitativos de interés. Otra ventaja que ofrecen los marcadores moleculares es que facilitan el monitoreo simultáneo de diferentes genes de resistencia, lo que posibilita la piramidización o apilamiento de genes, que consiste en la combinación, en un único cultivar, de diferentes genes que confieren resistencia específica a distintas razas de un determinado patógeno. Esta es una estrategia de gran utilidad para lograr estabilidad en la resistencia a largo plazo y fue aplicada en poroto para reunir diferentes genes de resistencia a virosis como el mosaico común y a enfermedades fúngicas como la antracnosis y la roya (Ragagnin et al., 2005; Miklas et al., 2006). Alternativamente genes que proveen resistencia parcial demostraron tener un rol importante en la determinación de resistencia duradera, al ser combinados con genes de resistencia específica (Johnson 1994; Wang et al., 1994; Geffroy et al., 2000).Hasta el momento se comprobó el ligamiento de diferentes marcadores moleculares a más de 30 genes de resistencia a diferentes enfermedades y un número similar de QTLs que codifican caracteres de importancia agronómica en el cultivo de poroto (http://www.css.msu.edu/bic/Genetics.cfm) (Benchimol et al., 2007; Cardoso et al., 2008; Gepts et al., 2008). Un ejemplo es el caso de la resistencia a la bacteriosis común, de herencia cuantitativa, que presenta más de 20 genes/QTLs identificados distribuidos a lo largo de los 11 grupos de ligamiento del mapa genético del poroto. Los marcadores SCAR SU91, SAP6 y BC420, localizados en los grupos de ligamiento Pv08, Pv10 y Pv06, respectivamente, son los marcadores moleculares más utilizados para la mejora de la resistencia a dicha enfermedad, ya que están ligados a QTLs de efecto mayor asociados a la resistencia a la bacteriosis común. Además, un nuevo QTL asociado a la resistencia a esta enfermedad fue descripto recientemente en el grupo de ligamiento Pv11, el cual presenta un marcador fuertemente ligado, que puede ser implementado en los programas de mejoramiento para seleccionar genotipos resistentes a la bacteriosis común (Viteri et al., 2014). La biotecnología molecular y el cultivo de poroto en el noroeste argentino (NOA)Como se mencionó anteriormente, son múltiples las aplicaciones de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético vegetal, desde la genética de los cultivos per se hasta el entendimiento de otros factores que afectan al cultivo, como puede ser el conocimiento de la diversidad patogénica, lo que permite adoptar estrategias para el manejo de una determinada enfermedad. La caracterización de la diversidad genética de las poblaciones de patógenos y malezas aporta información de gran utilidad tanto para el diseño de programas de control más eficaces, como para la búsqueda de germoplasma resistente. Un ejemplo para la región del NOA son los estudios referidos a la diversidad del patógeno Pseudocercospora griseola, agente causal de la mancha angular del poroto. En 2007 se realizó la caracterización patogénica y molecular de la primera colección de aislamientos de P. griseola de la Argentina (Stenglein, 2007). Se identificaron 13 razas fisiológicas o patotipos y se determinó que el patógeno posee una alta diversidad genética en la región del NOA, similar a la descripta para otros países productores. Estos estudios fueron útiles para la obtención de una variedad con alta tolerancia a mancha angular desarrollada en la EEAOC (Vizgarra et al., 2010). Del mismo modo, se realizaron estudios moleculares de otros patógenos que afectan al cultivo de poroto, como ser Rhizoctonia solani, agente causal de la mustia hilachosa (Spedaletti et al., 2013 y 2014); en base al conocimiento de la diversidad genética de las poblaciones de este patógeno en la zona, se está realizando la evaluación de germoplasma para la identificación de genotipos resistentes a la enfermedad. Los marcadores moleculares también facilitan el estudio del germoplasma nativo orientado a la búsqueda de genes de interés para su aprovechamiento en los programas de mejoramiento, como así también para definir estrategias de conservación de la biodiversidad. La región del NOA representa el límite sur del centro andino de diversificación del poroto, por lo que es posible encontrar en la zona gran variedad de razas locales o primitivas y porotos silvestres (Parodi, 1966; Castagnaro et al., 1990). A partir del uso de diferentes marcadores moleculares se estudió la diversidad genética de las poblaciones de poroto silvestre que crecen en el NOA, lo que permitió evaluar su estado de conservación e identificar áreas para la colecta de germoplasma y para la conservación in situ (Ortega-Baes et al., 2009; Galván et al., 2010). Se identificaron poblaciones que se encuentran amenazadas debido a la restricción progresiva de su hábitat a zonas marginales y al avance de la deforestación y el pastoreo. Entre dichos materiales silvestres se identificaron genotipos resistentes a diferentes razas del hongo P. griseola lo que demostró la importancia de continuar coleccionando poblaciones, especialmente las más amenazadas, para evitar la pérdida de variantes alélicas que pueden ser de importancia para el mejoramiento genético del cultivo.En relación a la obtención de nuevas variedades, la EEAOC trabaja intensamente con el objetivo de mejorar la productividad, por tanto la competitividad, del poroto negro como alternativa de cultivo estival en ciertas áreas del NOA. En la actualidad, todas las variedades comerciales de poroto negro y de otros colores que se cultivan en esta región presentan distintos grados de susceptibilidad a la bacteriosis común y a la mancha angular. Esto representa una situación de alto riesgo para el futuro y un desafío adicional en los trabajos de mejoramiento genético. La identificación de nuevas líneas con altos niveles de tolerancia a dichas enfermedades es el primer paso hacia la obtención de nuevas variedades de poroto que combinen buena adaptación y rendimientos, con un mejor comportamiento frente a estos patógenos. Para alcanzar este objetivo, se realizaron diversos cruzamientos dirigidos involucrando germoplasma local de buen comportamiento pero con severa susceptibilidad a las enfermedades mencionadas y progenitores resistentes aportados por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Cali, Colombia), a partir de los cuales se originaron diversas familias (F1). La primeras evaluaciones y la selección individual se basó en características fenotípicas, siguiendo las pautas establecidas en el Sistema Estándar para la Evaluación de Germoplasma de Frijol (CIAT, 1987). A partir de la generación F2, todas las líneas fueron evaluadas en las condiciones agroecológicas del NOA, donde los genotipos de altos rendimientos potenciales y resistentes a la mancha angular y a la bacteriosis común se fueron seleccionando en las sucesivas generaciones endocriadas hasta F6. El germoplasma resultante fue evaluado en Ensayos Preliminares (EP) y con posterioridad en Ensayos Comparativos de Rendimiento (ECR). Actualmente se cuenta con varias líneas que cumplen con las características deseadas. Estas líneas están siendo analizadas genéticamente mediante SSR, a fin de estimar su parecido genético e identificar inequívocamente estos materiales fitotécnicos (genotipos). Además, se evaluará la presencia de los marcadores moleculares SCAR SU91 y SAP6 ligados a la resistencia a la bacteriosis común, a fin de determinar su presencia en las líneas obtenidas.De este modo, en estrecha y estratégica colaboración, un equipo de investigadores, técnicos y operarios especializados en genética agronómica molecular y pertenecientes al INTA (Salta), al CONICET (Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino- ITANOA-) y a la EEAOC, trabajan con el doble propósito de contribuir con la seguridad alimentaria y el de incrementar la sostenibilidad económica, ambiental y social de un cultivo clave para el noroeste del país.