Funcion biologica de la histona H2B.Z de Toxoplasma gondii

MUNOZ D; GANUZA A; ANGEL SO; VANAGAS L

Resistencia

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2018

Sociedad Argentina de Protozoología

Toxoplasma gondii es un par´asito intracelular obligado de humanos y animales, perteneciente al PhylumApicomplexa. Los moduladores epigen´eticos y la alteraci´on de la estructura de la cromatina son muy importantes en la regulaci´on de la expresi´on g´enica, la replicaci´on y el mecanismo de reparaci´on del ADN. Lashistonas can´onicas y variantes son componentes principales de la cromatina. H2B.Z es una histona variante´unica de Apicomplexa que conforma nucleosomas con H2A.Z en T.gondii, posicion´andose mayormente enpromotores de genes transcripcionalmente activos. Ambas histonas son modificadas post-traduccionalmentey nuestra hip´otesis es que esta regulaci´on epigen´etica es fundamental para el pasaje de estadio taquizoitoa bradizoito. Para determinar la importancia biol´ogica de H2B.Z y de sus acetilaciones N-terminales obtuvimos par´asitos que sobre-expresan la histona salvaje (c-Myc-WT) o mutantes: con las 5 lisinas acetilablesmutadas ya sea por alaninas (c-Myc-A) (amino´acido neutro) o por argininas (c-Myc-R) (amino´acido concarga positiva), todas ellas etiquetadas con c-Myc. Los par´asitos no mostraron diferencias significativas en sutasa de replicaci´on, pero observamos un aumento de la tasa de diferenciaci´on para la mutante c-Myc-R comparada con el parental, y una disminuci´on de la misma en la mutante c-Myc-A. Dado que H2B.Z es esencialpara la sobrevida del par´asito, decidimos realizar la disrupci´on g´enica del gen end´ogeno mediante el sistemaCRISPR/CAS9, en los par´asitos que sobre-expresan las histonas mutadas. Para esto, se dise~naron sgRNAsde 20-40 nucle´otidos del marco de lectura abierto del gen H2B.Z de la regi´on N-terminal. Se co-transfectaronlos par´asitos con el vector y un amplic´on portando el cassette de selecci´on de DHFR + regiones de homolog´ıacon el 3´y 5´UTR de la histona end´ogena para inserci´on disruptiva por doble recombinaci´on hom´ologa. Laeficiencia de la transfecci´on fue analizada por Inmunofluorescencia Indirecta. Se seleccionaron los par´asitoscon pirimetamina y luego de 3 pasajes se clonaron por diluci´on l´ımite. Los clones fueron analizados porPCR y Western Blot, adem´as de enviarse a secuenciar. Los ensayos fenot´ıpicos preliminares muestran unaumento en la tasa de diferenciaci´on para los par´asitos c-Myc-R, cuya histona end´ogena fue delecionada.En conclusi´on, las acetilaciones en el N-terminal de la histona H2B.Z tendr´ıan una funci´on importante enel proceso de diferenciaci´on del par´asito.