Implementación de una plataforma para la obtención de virus fowlpox recombinantes.

CARLOS FEDERICO; FLAVIA ZANETTI; GABRIELA CALAMANTE

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Otro; Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología (SAV 2013).; 2013

Asociación Argentina de Microbiología

El virus fowlpox (FWPV) es el avipoxvirus mejor estudiado y caracterizado. Posee un genoma de ADN doble cadena que replica en el citoplasma de las células hospedadoras. Estos virus son capaces de infectar productivamente solo especies aviares aunque pueden causar infecciones abortivas en células no aviares, convirtiéndolos en buenos candidatos para el desarrollo de vacunas de nueva generación tanto para aves como para mamíferos. Teniendo en cuenta que los sistemas de obtención de poxvirus recombinantes no están disponibles comercialmente, resulta estratégico implementar metodologías de manera local para utilizarlas en el diseño de estas vacunas. El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de una plataforma que permita obtener FWPV recombinantes que expresen proteínas de interés, utilizando como modelo a la proteína fluorescente verde (GFP). Debido a que el tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN se utilizan vectores de transferencia con secuencias genéticas que permiten la recombinación homóloga con el virus salvaje. Mediante amplificación por PCR se obtuvieron dos regiones, denominadas izquierda y derecha, que serán el sitio blanco de recombinación y corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030, el cual no es esencial para la replicación viral in vitro. Los amplicones obtenidos se clonaron en el vector TopoTA, sus identidades se confirmaron por secuenciación y se subclonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L del virus vaccinia río arriba de un sitio de clonado múltiple y b) un casete para la expresión del gen marcador uidA (codifica para la enzima beta glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el vector de transferencia universal (VT) en el cual se clonó el gen codificante para la proteína GFP río abajo del promotor pE/L. Este VT se transfectó en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se incubó hasta la aparición de efecto citopático generalizado. Posteriormente, el aislamiento de los virus recombinantes se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo agar mediante su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia de X-Gluc, sustrato de la enzima GUS. Luego, se aisló un stock viral en el cual se confirmó la presencia y expresión de la región codificante del gen gfp mediante PCR y microscopía confocal, respectivamente. En este trabajo se obtuvieron FWPV recombinantes que expresan la proteína GFP. Además, se implementó por primera vez en nuestro país la plataforma que permitirá obtener FWPV recombinantes para la expresión de distintas proteínas de interés con múltiples aplicaciones tales como el desarrollo de vacunas de nueva generación.