VIRUS CANARYPOX RECOMBINANTES QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA. SU OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN COMO INMUNÓGENOS DE NUEVA GENERACIÓN EN POLLOS.

FLAVIA ZANETTI; ROMINA MITAROTONDA; FLORENCIA FERRER; GABRIELA CALAMANTE

Paseo La Plaza, Buenos Aires. Argentina.

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008

Sociedad Argentina de Microbiologia

La enfermedad de Gumboro o bursitis infecciosa (IBD) es una enfermedad aguda muy contagiosa que causa inmunosupresión y alta mortalidad en pollos jóvenes, generando importantes pérdidas económicas en la industria avícola. Su agente etiológico, el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), es un miembro del género Avibirnavirus que produce destrucción de los linfocitos B que maduran en la bursa de Fabricio. Actualmente, el control de la enfermedad se realiza mediante la administración de vacunas basadas en virus inactivados o cepas virales con diferentes grados de atenuación, que si bien inducen una respuesta de anticuerpos seroneutralizantes resultan poco efectivas en presencia de anticuerpos maternos. Durante los últimos años el virus canarypox (CNPV) se evaluó exitosamente como vector viral no replicativo para la expresión in vivo de antígenos heterólogos. El objetivo de este trabajo es el desarrollo y evaluación de inmunógenos basados en CNPV recombinantes candidatos a vacunas contra IBD. En este contexto, obtuvimos un virus canarypox recombinante que porta y expresa la región codificante de la proteína estructural VP2 de IBDV. Para ello, la secuencia nucleotídica codificante de esta proteína se amplificó por RT-PCR, a partir de muestras de ARN total purificadas de cultivos celulares infectados con IBDV. El producto de amplificación se clonó en un vector de transferencia previamente obtenido en nuestro laboratorio y la identidad de los plásmidos recombinantes se corroboró por secuenciación. El vector de transferencia obtenido VT-GUS-VP2 permitió la posterior inserción del gen de interés dentro del genoma de CNPV por reemplazo alélico del gen no esencial CNPV048 que codifica para una fosfodiesterasa celular. Este vector contiene, además, un cassette para la expresión de GUS (enzima marcadora que permite el rastreo de los virus recombinantes). La obtención CNPV recombinantes se realizó transfectando el VT-GUS-VP2 en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (FEP) infectados con CNPV. La selección del virus recombinante CNPV-VP2 se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo agar y análisis de la expresión del gen marcador (capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato X-gluc). Una vez obtenido un stock homogéneo (100% de placas de lisis azules), el virus recombinante se amplificó para analizar la presencia y expresión del gen de interés mediante técnicas moleculares. Así, se realizó una PCR diferencial que permitió confirmar la presencia del gen foráneo en el virus recombinante y la pureza del mismo (ausencia del genoma de CNPV salvaje). La expresión del gen heterólogo se confirmó mediante la técnica de Western blot utilizando antisueros específicos contra IBDV donde se observó la presencia de una banda reactiva correspondiente a la proteína VP2. La capacidad inmunogénica de CNPV-VP2 se evaluó por inoculación del virus recombinante en pollos libres de patógenos específicos. Los niveles de anticuerpos totales y seroneutralizantes se analizaron a diferentes tiempos post-inmunización. La presencia de anticuerpos totales en el suero de las aves inmunizadas se determinó utilizando el kit de ELISA comercial FlockCheck IBD (IDEXX). Además, la inmunización con CNPV-VP2 indujo una potente respuesta de anticuerpos seroneutralizantes de IBDV (título 3,37 para una reducción del 50% de placas de lisis). Se obtuvo un virus canarypox recombinante CNPV-VP2 que porta y expresa la proteína heteróloga y que fue capaz de inducir en pollos una respuesta inmune de tipo humoral con presencia de anticuerpos seroneutralizantes de IBDV.