METODOLOGÍAS PARA EVALUAR LA RESPUESTA INMUNE INDUCIDA POR EL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA.

MITAROTONDA, ROMINA; CALAMANTE, GABRIELA; FERRER, MARÌA FLORENCIA; ZANETTI, FLAVIA

Complejo Turístico de Vaquerías, Córdoba,

Encuentro; XXVII Reunión Científica Anual de Sociedad Argentina de Virologìa; 2007

Sociedad Argentina de Virologìa

La enfermedad de Gumboro es de origen viral, altamente contagiosa que produce infecciones severas en las aves de cría intensiva causando importantes pérdidas económicas en la industria avícola. El agente etiológico de la enfermedad de Gumboro es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un miembro de la familia Birnaviridae que produce destrucción de los linfocitos B (IgM positivos) que maduran en la bursa de Fabricius de las aves. La tasa de mortalidad es muy alta (>50%) en pollos de 3 a 6 semanas de edad, mientras que en aves menores a 2 semanas se genera inmunosupresión crónica severa sin aparición de signos clínicos. El control de IBD es efectivo mediante la administración de vacunas a virus inactivados o atenuados, así como también por vacunas de nueva generación que protegen contra cepas emergentes surgidas como variantes muy virulentas de IBDV (vvIBDV). En nuestro laboratorio se desarrollan vacunas de nueva generación para prevenir la enfermedad de Gumboro. Para ello, el objetivo de este trabajo consistió en la implementación de las metodologías que permiten evaluar la respuesta inmune inducida por IBDV en pollos. Con el propósito de disponer de anticuerpos específicos dirigidos contra IBDV, se amplificó una cepa vacunal de virulencia intermedia de IBDV en cultivos primarios de embrión de pollo (FEP) y se estableció un protocolo de purificación que involucra los pasos de concentración viral utilizando PEG 6000, ultracentrifugación a través de colchón de sacarosa 40% y gradiente discontinuo de sacarosa (40-50-60%). El virus así purificado fue formulado en adyuvante incompleto de Freund e inoculado en pollos SPF de 21 días de edad. Los pollos recibieron dos dosis (a los 21 y 35 días) y se realizaron sangrías exploratorias a los 35, 42, 49 y 60 días. La presencia de anticuerpos específicos se confirmó mediante Western blot (contra el virus purificado) y mediante ELISA IBDV (IDEXX Laboratories). Las muestras de sueros correspondientes a todas las sangrías fueron positivas, observándose un aumento en el título IDEXX luego de la dosis refuerzo. Para poder cuantificar el título de IBDV se infectaron cultivos FEP con la cepa vacunal D78 (de virulencia intermedia, Laboratorios Delamer). El título viral se calculó tanto por visualización de placas de lisis (unidades formadoras de placa/ml) como por la técnica de Reed y Muench (observación del efecto citopático a dilución límite). El stock viral de trabajo posee un título de 3,2 x 10 Exp+06 ufp/ml o 4,8 x 10 Exp+06 DICT50/ml, respectivamente. Las cepas vvIBDV no crecen fácilmente en cultivo. Para cuantificar el stock viral de la cepa DL/847/04 (caracterizada como vvIBDV por RT-PCR, RFLP y secuenciación) se realizó una titulación a dilución límite en embriones SPF de 10 días. Para calcular la dosis letal 50 (DL50) se contabilizaron los embriones infectados que murieron dentro de los 7 días post infección. El stock viral de vvIBDV DL/847/04 posee un título de 1,9 x 10 Exp+04 DL50/ml. Las vacunas dirigidas contra IBDV inducen anticuerpos neutralizantes de la infección y para poder evaluarlos se implementó la técnica de cuantificación de la infectividad residual. Entonces, diluciones seriadas del suero anti-IBDV producido (sangría 4) fueron enfrentadas con una cantidad fija de una cepa intermedia de IBDV (100 DITC50), se incubó 1 h a 37ºC y la infectividad residual fue calculada por la técnica de Reed y Muench. El suero anti-IBDV fue capaz de neutralizar las 100 DICT50 de IBDV hasta una dilución 1/50000. Finalmente, la respuesta inmune inducida por la vacuna oral contra IBDV (viva atenuada; cedida por Laboratorios Delamer) se evaluará en un ensayo de inmunización en pollos. En este trabajo se obtuvo un suero específico contra IBDV que también posee una alta capacidad seroneutralizante. Además, se implementaron diferentes metodologías para detectar y cuantificar la presencia de IBDV o de anticuerpos dirigidos contra dicho virus. Los resultados obtenidos constituyen las herramientas metodológicas básicas que perrmitirán evaluar nuevas vacunas contra IBDV.