INVESTIGADORES
ZANETTI Flavia Adriana
congresos y reuniones científicas
Título:
OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA A PARTIR DE CULTIVOS BACTERIANOS
Autor/es:
FLAVIA ZANETTI; ROMINA CARDONA; GABRIELA CALAMANTE
Lugar:
Ciudad Autònoma de Buenos Aires
Reunión:
Encuentro; III Encuentro Latinoamericano de Virólogos. X Congreso Argentino de Virología.; 2011
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virologìa
Resumen:
El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) produce destrucción de los linfocitos B que maduran en la bolsa de Fabricio de las aves. La proteína viral VP2, componente de la cápside viral icosaédrica, es el único antígeno viral que induce inmunidad protectora caracterizada por la inducción de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo existe poca información sobre la importancia de la respuesta inmune celular en la protección contra IBDV inducida por las vacunas recombinantes. Las investigaciones de nuestro grupo están dirigidas al diseño racional de vacunas basadas en poxvirus recombinantes no replicativos para la prevención de IBDV. Para realizar estudios comparativos de vacunas a subunidades y vectores poxvirales es fundamental disponer de una herramienta molecular, la proteína VP2, que nos permita realizar ensayos El objetivo de este trabajo es la optimización del método de purificación de la proteína VP2 recombinante (VP2r) expresada en bacterias. La secuencia codificante de la proteína VP2 madura se amplificó por RT-PCR a partir de ARN total purificado de de embrión de pollo infectados con el aislamiento LD-847/04 de IBDV. El amplicón obtenido se clono en el vector TOPO-TA, luego su inserto se subclonó en el vector de expresión pRSet y se transformaron bacterias E. coli BL21 plys. La identidad del inserto se confirmó por secuenciación. Luego, se evaluó la expresión de VP2r en cultivos bacterianos y se determinó el tiempo de máxima expresión y su solubilidad. Se observó que VP2r se encontraba en la fracción insoluble y que fue posible su solubilización a altas concentraciones de urea o isotiocianato de guanidinio. En todos los casos, la presencia de VP2r se detectó mediante la técnica de Western blot utilizando un anticuerpo dirigido contra el tracto de 6 histidinas presentes en el extremo N-terminal de VP2r. La purificación se realizó en condiciones desnaturalizantes utilizando resina Ni-NTA agarosa. Se evaluaron diferentes protocolos, tanto para la unión de VP2r a la resina como diferentes formas de elución de dicha proteína. El protocolo que permitió obtener la proteína VP2r más pura (definido como ausencia de otras bandas proteicas en PAGE-SDS/Coomassie) fue pre-bloqueando la resina con una solución de histidina (His, 20mM), utilizando el buffer GA-urea para su solubilización, realizando la unión en batch, los lavados (al menos 10) y las eluciones (con concentraciones crecientes de His) en columna. Finalmente, aquellas fracciones que contenían la proteína VP2r fueron sometidas a un paso adicional de purificación basado en PAGE-SDS, tinción con azul de Coomassie, escisión de la banda proteica y electroelución (2 h a 200V). El rendimiento del proceso fue de 0,8 mg de proteína VP2r por litro de cultivo bacteriano. Se logró purificar la proteína VP2r a partir de cultivos bacterianos utilizando un protocolo optimizado que combina diferentes pasos de protocolos estándares. El último paso permitió obtener un mayor grado de pureza y eliminar los agentes desnaturalizantes que interferirían con los ensayos.