Diseño y construcción de un vector de transferencia para la obtención de virus fowlpox recombinantes.

FEDERICO, C.; ZANETTI, F.; CALAMANTE, G.

Valle Hermoso, Pcia. de Còrdoba

Encuentro; Reuniòn Cientìfica Anual de la Sociedad Argentina de Virologìa; 2012

Asociaciòn Argentina de Microbiologìa

El virus fowlpox (FWPV) es el avipoxvirus mejor estudiado y caracterizado, y se lo utiliza como vector de expresión en el desarrollo de vacunas contra enfermedades aviares. Posee un genoma de ADN doble cadena que replica en el citoplasma de las células hospedadoras. Estos virus son capaces de infectar productivamente sólo especies aviares aunque pueden causar infecciones abortivas en células no aviares, convirtiéndolos en buenos candidatos para el desarrollo de vacunas de nueva generación tanto para aves como para mamíferos. Teniendo en cuenta que los sistemas de obtención de poxvirus recombinantes no están disponibles comercialmente, resulta estratégico implementar las metodologías de manera local para utilizarlas en el diseño de estas vacunas. El objetivo de este trabajo es diseñar y construir un vector de transferencia (VT) que permita obtener virus fowlpox recombinantes que expresen proteínas de interés. El tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN por técnicas de ingeniería genética. Es por ello que se utilizan vectores de transferencia que portan secuencias que permitirán la recombinación homóloga in vivo con el virus salvaje. Para ello se seleccionó el gen FPV030 como sitio blanco de inserción en el genoma de FWPV porque fue descripto como no esencial para la replicación in vitro. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar por PCR dos regiones denominadas izquierda y derecha que corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030. Los amplicones obtenidos se clonaron en el vector TopoTA, se confirmaron su identidades por secuenciación y se subclonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L del virus vaccinia río arriba de un sitio de clonado múltiple y b) un cassette para la expresión del gen marcador uid A (codifica para la enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el vector de transferencia universal en el cual se clonaron los genes de interés río abajo del promotor pE/L. Se seleccionaron los genes codificantes para la proteína fluorescente verde (GFP) o para la proteína VP2 madura del virus de la bursitis infecciosa. De esta forma se obtuvieron dos vectores de transferencia denominados VT-F030-GFP y VT-F030-VP2. Estos VT se transfectaron en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se confirmó la presencia de células fluorescentes verdes o azules en presencia del sustrato de GUS, respectivamente. En este trabajo se diseñó y construyó el vector de transferencia universal que permitirá la obtención de virus fowlpox recombinantes por inserción en el gen viral FPV030. Además se construyeron dos VT que portan las secuencias codificantes de la proteína VP2 de IBDV o de GFP, confirmándose la expresión de las proteínas marcadoras en cultivos infectados con FWPV y transfectados con dichos VT. El objetivo de este trabajo es diseñar y construir un vector de transferencia (VT) que permita obtener virus fowlpox recombinantes que expresen proteínas de interés. El tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN por técnicas de ingeniería genética. Es por ello que se utilizan vectores de transferencia que portan secuencias que permitirán la recombinación homóloga in vivo con el virus salvaje. Para ello se seleccionó el gen FPV030 como sitio blanco de inserción en el genoma de FWPV porque fue descripto como no esencial para la replicación in vitro. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar por PCR dos regiones denominadas izquierda y derecha que corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030. Los amplicones obtenidos se clonaron en el vector TopoTA, se confirmaron su identidades por secuenciación y se subclonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L del virus vaccinia río arriba de un sitio de clonado múltiple y b) un cassette para la expresión del gen marcador uid A (codifica para la enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el vector de transferencia universal en el cual se clonaron los genes de interés río abajo del promotor pE/L. Se seleccionaron los genes codificantes para la proteína fluorescente verde (GFP) o para la proteína VP2 madura del virus de la bursitis infecciosa. De esta forma se obtuvieron dos vectores de transferencia denominados VT-F030-GFP y VT-F030-VP2. Estos VT se transfectaron en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se confirmó la presencia de células fluorescentes verdes o azules en presencia del sustrato de GUS, respectivamente. En este trabajo se diseñó y construyó el vector de transferencia universal que permitirá la obtención de virus fowlpox recombinantes por inserción en el gen viral FPV030. Además se construyeron dos VT que portan las secuencias codificantes de la proteína VP2 de IBDV o de GFP, confirmándose la expresión de las proteínas marcadoras en cultivos infectados con FWPV y transfectados con dichos VT. El objetivo de este trabajo es diseñar y construir un vector de transferencia (VT) que permita obtener virus fowlpox recombinantes que expresen proteínas de interés. El tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN por técnicas de ingeniería genética. Es por ello que se utilizan vectores de transferencia que portan secuencias que permitirán la recombinación homóloga in vivo con el virus salvaje. Para ello se seleccionó el gen FPV030 como sitio blanco de inserción en el genoma de FWPV porque fue descripto como no esencial para la replicación in vitro. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar por PCR dos regiones denominadas izquierda y derecha que corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030. Los amplicones obtenidos se clonaron en el vector TopoTA, se confirmaron su identidades por secuenciación y se subclonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L del virus vaccinia río arriba de un sitio de clonado múltiple y b) un cassette para la expresión del gen marcador uid A (codifica para la enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el vector de transferencia universal en el cual se clonaron los genes de interés río abajo del promotor pE/L. Se seleccionaron los genes codificantes para la proteína fluorescente verde (GFP) o para la proteína VP2 madura del virus de la bursitis infecciosa. De esta forma se obtuvieron dos vectores de transferencia denominados VT-F030-GFP y VT-F030-VP2. Estos VT se transfectaron en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se confirmó la presencia de células fluorescentes verdes o azules en presencia del sustrato de GUS, respectivamente. En este trabajo se diseñó y construyó el vector de transferencia universal que permitirá la obtención de virus fowlpox recombinantes por inserción en el gen viral FPV030. Además se construyeron dos VT que portan las secuencias codificantes de la proteína VP2 de IBDV o de GFP, confirmándose la expresión de las proteínas marcadoras en cultivos infectados con FWPV y transfectados con dichos VT.