OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE Lotus glaber PORTADORAS DEL GEN CODIFICANTE DE ARGININA DESCARBOXILASA

FABIANA D. ESPASANDÍN, PEDRO A. SANSBERRO, MÓNICA M. COLLAVINO, OSCAR A. RUIZ Y LUIS A.MROGINSKI

Chascomús. Argentina

Congreso; XXVI Reunión Argentina de Fisiología Vegetal; 2006

SAFV

Con el propósito de lograr un sistema que permita la transformación genética y obtención masiva de plantas transgénicas de Lotus glaber, fragmentos foliares extraídos de plántulas obtenidas por la germinación in vitro de semillas de una población mejorada por selección recurrente (“INTA-PAMPA”), fueron transformados mediante infección con el vector binario pBi RD29A-ADC de Agrobacterium tumefaciens, portador del gen de la arginina descarboxilasa (ADC) de avena, bajo el control del promotor inducible RD29A; conteniendo además como marcador selectivo, el gen nptII codificante de neomicina transferasa. A tal fin, los segmentos foliares fueron inoculados con una suspensión de A. tumefaciens (OD600= 0.6) y co-cultivados a 28ºC en el medio de regeneración (MS + ANA y BA) durante 3 días en oscuridad. Seguidamente, los explantes transformados fueron seleccionados adicionándose al medio de cultivo kanamicina (30 μg/ml) y cefotaxina (400 μg/ml) e incubados en luz (fotoperíodo 14 hs., 118 mmol·m-2·s-1 PAR) y 27±2ºC. Cada 3 semanas, los explantes fueron subcultivados a medios selectivos frescos a fin de mantener la presión de selección y evitar la proliferación bacteriana. Transcurridos 45 días de cultivo, los brotes neoformados fueron transferidos a las fases de elongación (MS), enraizamiento (MS + IBA) y rustificación. Las plantas resistentes a kanamicina fueron analizadas mediante amplificación (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos para el gen nptII. Posteriormente, segmentos uninodales extraídos de las plantas genéticamente modificadas fueron cultivados en un medio de multiplicación (MS + BA), lográndose el escalado de la producción, manteniéndose estable la presencia del transgen en las plantas clonadas. En conclusión, este procedimiento permite la transformación genética, obtención y micropropagación de plantas transgénicas de Lotus glaber portadoras del gen codificante de arginina descarboxilasa.