INVESTIGADORES
ZANETTI Flavia Adriana
congresos y reuniones científicas
Título:
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS FOWLPOX RECOMBINANTES QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA
Autor/es:
FEDERICO, CARLOS RODILFO; ZANETTI FLAVIA; CALAMANTE GABRIELA
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Virología (CAV 2015)- II Congreso Latinoamericano de Virología- IV Simposio de Virología Clínica- II Simposio de Virología Veterinaria.; 2015
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
El virus fowlpox (FWPV) es el avipoxvirus mejor estudiado y caracterizado, posee un genoma de ADN doble cadena y se lo utiliza como vector de expresión en el desarrollo de vacunas de nueva generación contra enfermedades aviares. La enfermedad de Gumboro es causada por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) y produce importantes pérdidas económicas en la industria avícola. Dicho virus produce una depleción de los linfocitos B que maduran en la bolsa de Fabricio causando una enfermedad aguda y muy contagiosa que provoca inmunosupresión y alta mortalidad en pollos jóvenes. La proteína VP2 de IBDV ha sido ampliamente estudiada por ser la más inmunogénica e inducir respuestas inmunes protectoras.En base a esto, el objetivo general del trabajo consistió en obtener y caracterizar molecularmente virus fowlpox recombinantes que expresen la proteína VP2 de IBDV.Debido a que el tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN, se utilizan vectores de transferencia (VT) con secuencias genéticas que permiten la recombinación homóloga con el virus salvaje. Mediante amplificación por PCR se obtuvieron dos regiones homólogas, que serán el sitio blanco de recombinación y corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030, el cual no es esencial para la replicación viral in vitro. Los amplicones obtenidos se clonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L y b) un cassette para la expresión del gen marcador uidA (codifica para la enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el VT universal en el cual se clonó la región codificante de la proteína VP2 de IBDV río abajo del promotor pE/L. Este VT se transfectó en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se incubó hasta la aparición de efecto citopático. Posteriormente, el aislamiento de los virus recombinantes se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo agar por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia de X-Gluc, sustrato de la enzima GUS. De esta forma, se obtuvo un stock viral puro y se confirmó la presencia de la región codificante del gen vp2mediante PCR. Para corroborar la expresión del gen se realizó una RT-PCR detectándose el ARN mensajero de VP2 a las 24hs post-infección. Adicionalmente, se evidenció la expresión de la proteína VP2 madura a las 24hs/48hs post-infección mediante un western blot, utilizando un anticuerpo anti-VP2 producido en conejo.De esta manera, en el presente trabajo se logró obtener FWPV recombinantes que expresan la proteína VP2 de IBDV. Las perspectivas a futuro incluyen evaluar su inmunogenicidad y eficacia en pollos libres de patógenos específicos, para su posible uso como vacuna de nueva generación contra la enfermedad de la bursitis infecciosa.