INVESTIGADORES
ZANETTI Flavia Adriana
congresos y reuniones científicas
Título:
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN VIRUS VACCINIA ANKARA MODIFICADO QUE EXPRESA PROTEÍNAS DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA
Autor/es:
FLAVIA ZANETTI; ROMINA MITAROTONDA; FLORENCIA FERRER; OSCAR TABOGA; GABRIELA CALAMANTE
Lugar:
Paseo La Plaza, Buenos Aires. Argentina.
Reunión:
Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Microbiologia
Resumen:
Los poxvirus se utilizan eficientemente como vectores para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas contra enfermedades infecciosas. En particular la cepa atenuada MVA (vaccinia Ankara modificado), obtenida por más de 500 pasajes en fibroblastos de embrión de pollo, se utiliza como vector de expresión no replicativo para la expresión de genes de interés in vivo ya que es incapaz de dar infección productiva en la mayoría de líneas celulares derivadas de mamíferos. El gran tamaño del genoma descarta la manipulación directa del ADN y los MVA recombinantes se obtienen por recombinación homóloga con un vector de transferencia (VT) que porta el gen de interés flanqueado por regiones genómicas, no esenciales para la replicación del virus in vitro, que serán blanco de inserción. Teniendo en cuenta que el ciclo replicativo de MVA ocurre en el citoplasma de la célula infectada y que la partícula viral compleja contiene las enzimas que realizan la transcripción de los genes tempranos, la expresión del gen de interés se encuentra regulada por promotores tempranos de poxvirus. El objetivo de este trabajo es la obtención y caracterización de un MVA recombinante que expresa la poliproteína del virus de la bursitis infecciosa (IBDV), patógeno de suma importancia en la industria avícola. Para ello, la región codificante de la poliproteína (pVP2-VP4-VP3) de IBDV se amplificó por RT-PCR a partir del genoma viral correspondiente a un aislamiento argentino. El producto de amplificación de 3 kpb se clonó en un vector T y, luego de confirmar su identidad por secuenciación, se subclonó en el vector de transferencia bajo regulación del promotor sintético temprano/tardío pE/L del virus vaccinia obteniéndose el VT denominado VT-M-poly. Con el propósito de facilitar la selección de los poxvirus recombinantes, el vector de transferencia porta un segundo cassette para la expresión del gen marcador uid A (codifica para la enzima beta-glucuronidasa, GUS). Los 2 cassettes de expresión se encuentran flanqueados por secuencias genómicas virales correspondientes al gen MVA086R (codifica para la enzima timidina quinasa) que permitirán la recombinación homóloga con el genoma de MVA. Para la obtención de los MVA recombinantes, cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (FEP) infectados con MVA se transfectaron con el VT-M-poly. Una vez ocurrida la recombinación homóloga in vivo los MVA recombinantes se identificaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato de la enzima GUS (X-Gluc). Los virus recombinantes fueron sometidos a sucesivos pasajes de clonado bajo agar hasta obtener un stock homogéneo (100% de placas de lisis azules). Luego, los virus recombinantes se caracterizaron para confirmar su pureza (ausencia de genoma viral no recombinante) y se evaluó la presencia y expresión del gen de interés utilizando técnicas moleculares. La inserción de la región codificante de la poliproteína se constató mediante 3 reacciones de PCR utilizando pares de oligonucleótidos que amplificaron los fragmentos correspondientes a las regiones 5?, central y 3?. La pureza del stock viral se corroboró mediante una reacción de PCR que permite amplificar solamente el gen tk del virus no recombinante. Finalmente, la expresión del gen foráneo se confirmó mediante la técnica de Western blot utilizando antisueros específicos contra IBDV y se observó la presencia de bandas reactivas correspondientes a las proteínas procesadas. Se obtuvo un virus MVA recombinante que porta y expresa el gen correspondiente a la poliproteína de IBDV. Además, la poliproteína heteróloga expresada a partir del poxvirus recombinante es capaz de procesarse (por la proteasa viral VP4) para liberar las proteínas estructurales VP2 y VP3 de IBDV.