EXPRESIÓN Y PURIFICACION DE LA NUCLEOPROTEINA DEL VIRUS DISTEMPER CANINO OBTENIDA DE UNA CEPA LOCAL, CON POTENCIAL APLICACIÓN EN EL DESARROLLO DE INMUNOGENOS DE NUEVA GENERACION

GALLO CALDERÓN MARINA; ROMANUTTI CARINA; BOADO LORENA; KELLER LETICIA; LA TORRE JOSE

CABA

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología; 2019

Asociación Argentina de Microbiología

El Virus Distemper Canino (VDC), miembro del género Morbillivirus, familia Paramyxoviridae, se encuentra en todo el mundo, afectando a mascotas y a especies silvestres. Si bien existen vacunas atenuadas, en los últimos años, se han registrado en nuestro país y a nivel mundial, un aumento de casos de DC (tanto en animales vacunados como en no vacunados). Dada la falta de actualización de las cepas vacunales, y al poseer el VDC un genoma a ARNsc, (con alta tasa de mutación), surgen cepas emergentes pobremente protegidas por los anticuerpos vacunales. En el ICT Milstein se viene realizando el diagnóstico molecular del VDC, entre otros patógenos caninos, lo cual nos permite estudiar las cepas salvajes que se encuentran circulando. Por otro lado, nos hemos propuesto el desarrollo de inmunógenos de nueva generación, para lograr un mejor y efectivo control de esta enfermedad. En este sentido, en un trabajo anterior, se reportó el clonado y la optimización de la expresión de la Nucleoproteína (NP) de VDC, de una cepa local, en {Escherichia Coli}. El objetivo del presente trabajo fue purificar la NP e iniciar su estudio como inmunógeno, en el modelo murino.A partir de cultivos de {E. Coli BL21} conteniendo el vector de expresión procariota (pRSET-B) con el gen completo de la NP de una cepa local, se realizaron inducciones por 5 hs a 37°C, con 1 mM de IPTG en medio LB. Los cultivos bacterianos, se lisaron mediante sonicación y tanto la fracción soluble como los cuerpos de inclusión fueron purificados por cromatografía de afinidad utilizando una resina de Cobalto. El análisis de la expresión y purificación, se realizó por SDS-PAGE con tinción de Coomassie Blue y, Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) anti NP. Se cuantificó la NPr obtenida mediante una curva de BSA, obteniendo una concentración estimada de 0.4 mg/ml y se puso a punto un ELISA con sueros caninos disponibles en el laboratorio y el mAb anti NP. Se determinó que 0.25 ug/ml de NPr era la óptima concentración para utilizar en los ELISA posteriores. Por otro lado, ratones Balb/c fueron inmunizados cada 15 días, por vía intraperitoneal, con 3 dosis conteniendo 10 μg de NPr purificada e hidróxido de Aluminio como adyuvante o con PBS. A las 2 semanas de la última inmunización, se colectaron muestras de sangre y con los sueros, se realizaron ensayos de ELISA y seroneutralización. Los ratones inmunizados con la NPr indujeron títulos mayores (3.7) a los títulos obtenidos con los ratones inmunizados con PBS (1.7), sin embargo, estos sueros no lograron neutralizar al virus en cultivo.Si bien los resultados presentados en este trabajo son preliminares, se logró obtener y purificar, por primera vez, la NPr de una cepa salvaje de VDC, utilizándose como inmunógeno en el modelo murino. Se planea a futuro estudiar la respuesta celular de estos animales, y eventualmente combinar el inmunógeno obtenido, en un esquema {prime-boost} heterólogo.