INVESTIGADORES
ROMANUTTI Carina
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de métodos de diagnóstico molecular para la detección de algunos patógenos virales caninos
Autor/es:
GALLO CALDERÓN MARINA; ROMANUTTI CARINA; PERIOLO OSVALDO; KELLER LETICIA; MATTION NORA; LA TORRE JOSE
Lugar:
Mar del PLata
Reunión:
Jornada; VIII Jornadas internacionales de veterinaria practica; 2013
Institución organizadora:
Colegio de Veterinarios de la Pcia. de Bs. As.
Resumen:
INTRODUCCION: Los cuadros de gastroenteritis en caninos, están caracterizados por diarreas y vómitos; sin embargo, existen excepciones dado que los síntomas clínicos que se pueden encontrar varían, observándose desde un animal casi normal con una leve apatía, hasta cuadros muy graves con fiebre, deshidratación, anemia, dolor abdominal intenso, decaimiento, shock y eventualmente, la muerte (1). Si bien existen diferentes etiologías de las gastroenteritis tales como: dietéticas, parasitarias y bacterianas; las gastroenteritis virales (GEV) son las de mayor gravedad particularmente en animales jóvenes. Las GEV en perros son causadas principalmente por cuatro virus: Parvovirus (PVC), Coronavirus (CVC), Rotavirus (RVC) y Virus Distemper canino (VDC). Las enfermedades infecciosas del tubo digestivo son, junto con las enfermedades respiratorias, como las producidas por el Adenovirus canino-2 (AVC-2) ó el Herpesvirus Canino, (CaHV-1), las entidades clínicas más frecuentes y temibles en los criaderos caninos. El principal problema de estas enfermedades radica generalmente en la dificultad para realizar el diagnóstico diferencial. En efecto, los síntomas son equívocos, y el diagnóstico final sólo puede establecerse a la luz de los resultados de las pruebas de laboratorio (2). Coronavirus Canino; los signos clínicos de la infección por CVC pueden variar mucho; desde una diarrea súbita que puede estar o no precedida de vómitos, anorexia, letargo con o sin fiebre, hasta una forma asintomática de la enfermedad con daño al intestino delgado y excreción del virus en las heces (3). El diagnóstico de la enfermedad puede ser difícil ya que el aislamiento del virus es problemático y la examinación al microscopio electrónico no está, por lo general, disponible en los laboratorios. Rotavirus canino, el RVC puede aislarse de perros clínicamente sanos o de perros con trastornos diarreicos. La acción patógena del RVC es semejante a la del CVC: se ven afectadas las células epiteliales apicales de las vellosidades intestinales del yeyuno y el íleon. Por lo general, el diagnóstico se basa principalmente en pruebas serológicas (2) (4) (5). El Adenovirus canino tipo 2 (AVC-2) causa laringotraqueitis. La confirmación del diagnóstico y la identificación, se basan generalmente en el aislamiento viral, en la microscopía electrónica y en análisis serológicos, sin embargo todas estas técnicas son laboriosas y consumen mucho tiempo. El AVC-2 es uno de los agentes causales de la traqueobronquitis infecciosa (TBI) o tos de las perreras, también conocida como rinotraqueitis infecciosa canina (Kennel cough) (6). Herpes Canino (CaHV-1), es el agente causal de una enfermedad hemorrágica mortal en cachorros menores de 4 semanas, abortos y también infecciones del tracto respiratorio superior y de la mucosa externa del aparato genital en adultos (7). El virus puede atravesar la barrera útero placentaria e infectar a los cachorros mientras aún están en el útero, o al exponerse a secreciones de la madre (8). Muchas veces, los casos clínicos producidos por este virus son mal diagnosticados como si fueran producidos por parvovirus o coronavirus. Por la severidad de las enfermedades anteriormente citadas y el impacto que producen las mismas en la salud animal, es que se hace imprescindible, el desarrollo de técnicas rápidas, específicas y sensibles que permitan la identificación inequívoca del patógeno actuante en cada caso, así como también el diagnóstico diferencial. Por lo tanto, al contar ya en nuestro laboratorio con el servicio de detección molecular para VDC y PVC, el objetivo de este trabajo, fue poner a punto la metodología necesaria para la identificación de otros cuatro patógenos (CVC, RVC, AVC-2, CaHV-1), utilizando una plataforma de diagnóstico molecular. MATERIALES Y METODOS: con el objeto de evaluar la efectividad y de ajustar los parámetros de ejecución, se realizaron las técnicas de PCR y RT-PCR para la detección de los diferentes patógenos virales, analizando vacunas comerciales (Coronavirus y Adenovirus), cultivos celulares infectados (Rotavirus) y preparados de necropsias previamente diagnosticadas por inmunofluorescencia (Herpesvirus). Extracción de ADN: Luego del tratamiento de las muestras con proteinasa K en un buffer de lisis, se extrajo el ADN con un sistema de adsorción de ácidos nucleicos a las partículas de sílica en presencia de altas concentraciones de sal (QiaexII, Qiagen®). La extracción de ARN se realizó con TRIZOL. Para las reacciones de PCR y RT-PCR, se utilizaron primers que reconocen secuencias génicas específicas de cada virus. Los productos obtenidos, fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1% y visualizados bajo luz UV. RESULTADOS: tanto en las vacunas comerciales analizadas, como en los cultivos celulares infectados con los diferentes virus, se detectaron los fragmentos génicos esperados. Para el AVC-2, se amplificó por PCR un fragmento de 1030 pares de bases (pb) del gen E3 y un fragmento de 493 pb del gen TK de CaHV-1. Para el caso de CVC y RVC se amplificaron por RT-PCR fragmentos de 409 pb del gen M y 1062 pb del gen 9, respectivamente. DISCUSION: Para el diagnóstico de CVC y RVC, se analizarán muestras de materia fecal. Para el diagnóstico molecular del AVC-2, la muestra que se analizará, es un lavado traqueobronquial ó un hisopado nasal u ocular. En caso de que el animal esté muerto, se obtendrán necropsias ó materia fecal. Para el diagnóstico del CaHV-1, se tomarán hisopados de la mucosa ocular, y/o genital y en el animal muerto, se toman muestras de órganos (riñón, pulmón hígado, bazo, páncreas). Las muestras deberán ser colocadas en un tubo estéril, enviarse a 4°C y serán acompañadas por una ficha clínica FICHA CLÍNICA que incluye información específica de cada animal. CONCLUSIONES: En este trabajo, se muestran los resultados preliminares de la puesta a punto de la metodología para detectar a nivel molecular, diferentes patógenos virales. De esta manera se dispone de una batería de ensayos diagnósticos rápidos, específicos y sensibles que permiten dilucidar la etiología de las enfermedades virales caninas más comunes.