Búsqueda de deleciones grandes en regiones del plastoma con repeticiones directas en plántulas portadoras del mutador de cloroplastos de la cebada

LENCINA F, BRIZUELA V, LANDAU A, PETTERSON ME, PACHECO MG, KOBAYASHI K, PRINA A.

la ciudad de San Fernando del Valle de Catamarca, Catamarca, Argentina

Congreso; XLVI Congreso Argentino de Genética y IV Jornada Regional NOA; 2017

SAG

IntroducciónAplicando TILLING dirigido al plastoma (cpTILLING) en plántulas portadoras del genotipo mutador de cloroplastos de cebada (cpm), se identificaron principalmente cambios puntuales y tres casos de deleciones de más de uno o dos pb. Estas deleciones grandes fueron de 45, 79 y 620 pb. Todas las deleciones tuvieron repeticiones directas en sus extremos. La causa de las deleciones sería la recombinación entre estas dos repeticiones y se produciría como una consecuencia del malfuncionamiento del gen cpm.En este trabajo se buscó determinar si este mecanismo de recombinación podría estar actuando en otras regiones del plastoma que también presentan repeticiones directas.Materiales y MétodosMediante el software REPuter se buscaron en el plastoma de cebada las regiones que contienen repeticiones directas de entre 20 y 40 pb de longitud y separadas por una distancia de hasta 200 pb. Se identificaron dos regiones con estas características: una contenida en el gen rpoC2 que codifica a la subunidad beta de la ARN polimerasa y la otra que contiene al gen trnfM del ARN de transferencia tRNA-Met (Fig.1). Se diseñaron cebadores para amplificar estas regiones por PCR y analizar la existencia de deleciones grandes mediante la digestión con Celery Juice Extract (CJE) según el protocolo de TILLING en 304 plántulas de cebada cpm que atravesaron muchas generaciones bajo el accionar del mutador.ResultadosSe seleccionaron para el análisis las repeticiones directas presentes en el gen rpoC2 y en la región que contiene al gen trnfM que presentaron identidad del 100%.La existencia de deleciones grandes se determinó mediante la detección de dos bandas de amplificación en el gel de poliacrilamida, tal como se realizó para la detección de las deleciones grandes identificadas mediante cpTILLING (Fig2).No se identificaron la existencia de deleciones grandes en ninguno de los dos amplicones analizados en las 304 plántulas cpm, ya que no se detectaron bandas dobles de amplificación que indiquen dichas deleciones. Sin embargo, se observaron digestiones en tres plántulas (Fig.3). Al analizar a las mismas, se identificaron una sustitución A 867 G en el amplicón rpoC2 en homoplasmía (no cambia el aminoácido en la proteína) y dos cambios en la región intergénica del amplicón trnfM. Estos fueron: una inserción de A luego de la posición 999 (en una seguidilla de A) en heteroplasmía y una sustitución A 662 G en homoplasmía.DiscusiónLas repeticiones directas en trnfM y rpoC2 tienen identidad del 100%, tamaño superior a 16 pb y están separados por una distancia apropiada, favoreciendo una recombinación, según lo postulado en bibliografía.Los resultados confirman la mayor tendencia del mutador cpm a producir cambios puntuales respecto de deleciones grandes, tal como se observó anteriormente en el ensayo de cpTILLING.ConclusionesEl mutador no produjo la recombinación de las repeticiones directas ubicadas en las regiones rpoC2 y trnfM en las plántulas analizadas pero si cambios puntuales.Figuras. Figura 1. Ubicación de los amplicones trnfM y rpoC2 en el plastoma de cebada. Se indican las repeticiones directas y los cebadores empleados para la amplificación.Figura 2. Amplificación de bandas dobles en plántulas portadoras de deleciones grandes previamente identificadas por cpTILLING en los amplicones rpl33 y psbA. La banda de amplificación de menor tamaño corresponde al amplicón portador de la deleción. Las bandas dobles de amplificación se indican con flechas rojas. Figura 3. Digestiones con CJE de los amplicones trnfM y rpoC2. La bandas de digestión se indican con flechas negras. No se obrsarvaron bandas dobles de amplificación.