MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA CONFOCAL DE ESCANEO LÁSER COMO HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO TAXONÓMICO DE MONOGENEOS DE LA FAM. DACTYLOGYRIDAE (MONOGENEA)

M. A. ROSSIN

San Carlos de Bariloche

Workshop; IX Congreso de Ecología y Manejo de Ecosistemas Acuáticos Pampeanos; 2018

INIBIOMA

Uno de los principales problemas en el estudio de la morfología estructural y funcional de los organismos pequeños, como los monogeneos dactylogyridos, es la dificultad que ofrecen sus estructuras diagnósticas para ser observadas y estudiadas tridimensionalmente, ya que los dibujos lineales bidimensionales y las microfotografías proporcionan imágenes parciales de su complejidad. La familia Dactylogyridae posee un gran número de especies que presentan una gran diversidad en su morfología. Su pequeño tamaño corporal requiere un considerable esfuerzo de muestreo y entrenamiento para colectarlos e identificarlos en branquias, piel, cavidades nasales y otros microhábitats. De hecho, las estructuras diagnósticas tales como piezas aptorales y el complejo copulador masculino son generalmente de tamaño menor a 100 μm de longitud y son esenciales para la descripción e identificación taxonómica. El objetivo de este estudio es proponer un método simple y rutinario para estudios morfológicos mediante microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser, que combina la digestión enzimática con proteinasa K para liberar estructuras esclerotizadas seguida por la observación por microscopía confocal. Este método es aplicable a especímenes frescos o fijados en formol 5% y alcohol 70%, y no requiere tinción o procesos de deshidratación. La observación de estas estructuras permitió detectar emisión de autofluorescencia estable (515/30 nm), cuando se excitó con láser de Krypton-argón (488 nm) a barras, anchor, y complejo copulador masculino. Se obtuvieron series fotográficas (80-100 láminas, stacks) correspondientes a cortes de 3-5 micras. Se utilizó software libre (Fiji) para el procesamiento de los stacks y para la reconstrucción tridimensional de estructuras esclerotizadas. Se generaron modelos 3D y vistas de 360º de rotación, así como proyecciones ortogonales. Las imágenes y modelos obtenidos permiten una visualización más apropiada y una mejor interpretación de las formas de estructuras diagnósticas. Se discuten las ventajas de este protocolo sobre las metodologías utilizadas en estudios previos.