Autodegradación de una metaloproteasa del veneno de Philodryas patagoniensis (Serpentes: Colubridae)

MARÍA ELISA PEICHOTO; LAURA REY; MARCELO LARAMI SANTORO; OFELIA ACOSTA

Resistencia

Encuentro; Comunicaciones Científicas y Tecnológicas de la UNNE 2009; 2009

Universidad Nacional del Nordeste

Recientemente se ha aislado, a partir del veneno de la culebra sudamericana Philodryas patagoniensis, una metaloproteasa de 57,5 kDa, a la cual se le dió el nombre de patagonfibrasa. Es sabido que metaloproteasas de masas moleculares semejantes a patagonfibrasa, aisladas a partir de venenos de especies de Bothrops (yararás), ejercen un procesamiento autoproteolítico, es decir, son capaces de actuar sobre ellas mismas degradándose. Como resultado de esta autoproteólisis se generan principalmente fragmentos de degradación que carecen de la porción enzimática, por lo tanto, ya no poseen actividad proteolítica. Teniendo en cuenta que hasta la fecha patagonfibrasa es la única metaloproteasa aislada en forma nativa a partir del veneno de una culebra, y considerando que ésta exhibe actividades biológicas similares a las presentadas por metaloproteasas de venenos de yararás de masas moleculares semejantes, en este trabajo se decidió estudiar la actividad autoproteolítica de patagonfibrasa. Por tal motivo, se incubó patagonfibrasa en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7.4) a 37ºC durante diversos intervalos de tiempo (0´; 5´; 15´; 30´; 1 h; 2 h; 18 h), en presencia y en ausencia de CaCl2 1 mM. Se detuvo la reacción de autólisis mediante el agregado de tampón de muestra conteniendo 2-mercaptoetanol, y se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Luego de la tinción con nitrato de plata, se analizaron los perfiles electroforéticos para la evaluación del procesamiento autoproteolítico de patagonfibrasa. Asimismo, se evaluó la actividad proteolítica, usando azocaseína como sustrato, de patagonfibrasa luego de incubada a 37ºC durante diversos intervalos de tiempo (0´; 5´; 15´; 30´; 1 h; 2 h; 18 h), en presencia y en ausencia de CaCl2 1 mM. Los resultados mostraron que patagonfibrasa es una enzima capaz de autodegradarse a 37ºC, siendo el principal fragmento de su autólisis una proteína de 30,9 kDa. Esta autodegradación es dependiente del tiempo de incubación, pudiéndose observar fragmentos autodegradativos a partir de los 5´ de incubación. Patagonfibrasa se autodegradó completamente, y por lo tanto, perdió totalmente su capacidad de hidrolizar azocaseína tras pre-incubación a 37ºC durante 18 h. Sin embargo, en presencia de CaCl2 1 mM, sólo se pudo detectar autodegradación parcial de la enzima en estudio tras 18 h de incubación, observándose como principal fragmento de autólisis una banda proteica de 49,5 kDa. Además, la actividad azocaseinolítica de patagonfibrasa se incrementó en un 50% cuando se pre-incubó a 37ºC en presencia de CaCl2 1 mM durante 18 h. Por tal motivo, podemos considerar que los iones Ca2+ son importantes para la estabilización estructural de patagonfibrasa, así como ya se ha demostrado que lo son también para otras metaloproteasas de venenos de serpientes estudiadas. Este estudio constituye el primer relato sobre la degradación autoproteolítica de una metaloproteasa del veneno de una especie de culebra, lo cual contribuirá a un mejor entendimiento de las bases estructurales y mecanísticas de esta clase de proteínas extensamente distribuidas tanto en los venenos de yararás como de culebras.