Expresión Heterologa y Purificación de un Péptido con Estructura Tipo-Ubiquitina de Natrialba magadii

ORDOÑEZ MV; NERCESSIAN D; DE CASTRO R; CONDE RD

Ciudad autonoma de Buenos Aires

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología General SAMIGE; 2007

Sociedad Argentina de Microbiologia General

La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos altamente conservada en todos los organismos eucariotas, pero son escasas las evidencias de su presencia en procariotas. Se han descripto proteínas tipo ubiquitina (Ubls), que presentan principalmente una baja homología de secuencia primaria, pero una alta homologia a nivel de estructura secundaria y funcional con ubiquitina. Las Ubls se encuentran tanto en eucariotas como en procariotas. En nuestro laboratorio se estudia la presencia de este tipo de proteínas en arqueas haloalcalófilas y haloneutrofilas. Mediante técnicas de PCR se ha aislado una secuencia de ADN del genoma del arquea haloalcalófila Natrialba magadii denominado p400. La secuencia de aminoácidos deducida de p400 presenta, al ser modelada, homología estructural con ubiquitina. Con el objetivo de corroborar los resultados obtenidos durante el modelado del fragmento p400 con herramientas bioinformáticas se decidió expresar dicho péptido en un sistema heterologo. En el presente trabajo se describe la expresión de dicha secuencia en la cepa Rosetta de Escherichia coli. El fragmento p400 fue subclonado en el vector pet24b que presenta una cola de histidina en su región C-terminal. Luego de la inducción con IPTG, el péptido expresado en este sistema se encontró en cuerpos de inclusión. Con el objetivo de estudiar su posible homología con ubiquitina se realizó la purificación del péptido mediante el uso de una cromatografía de afinidad en columna de Níquel. La purificación se realizó bajo condiciones desnaturalizantes en presencia de cloruro de guanidinio y urea. Las proteínas eluidas de la columna de níquel fueron resueltas por electroforesis en geles de poliacrilamida 12% en condiciones semidesnaturalizantes. La proteína purificada fue cortada del gel y sus fragmentos trípticos se secuenciaron mediante HPLC-MS/MS. A partir del alineamiento de las secuencias obtenidas se pudo corroborar que la secuencia del péptido expresado se corresponde con la secuencia de aminoácidos deducida con anterioridad. Para comprobar que el péptido expresado también tuviera reactividad con el anticuerpo anti-ubiquitina, se llevaron a cabo ensayos de inmunoreactividad. La proteína solo mostró reactividad con dicho anticuerpo luego de ser incubada en buffer conteniendo 3M NaCl. Estos resultados son esperados ya que se sabe que las proteínas de arqueas halófilas requieren de una alta concentración de sal para obtener un correcto plegamiento. Financiado por CONICET y UNMdP.