INVESTIGADORES
DEL MONACO Silvana Maria
congresos y reuniones científicas
Título:
CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LA TOXINA KILLER SeKT PRODUCIDA POR Saccharomyces eubayanus
Autor/es:
VILLALBA, L.; LOPES C.; ROBREDO, E; DEL MÓNACO S.; SANGORRIN, M. P.
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología; 2013
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
El fenómeno killer en levaduras ha sido descripto en diferentes especies, pero no hay reportes en Saccharomyces eubayanus. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad killer de 13 cepas de S. eubayanus aisladas de Araucaria araucana y realizar la optimización de las condiciones de producción de la toxina killer producida por una de ellas, su caracterización bioquímica preliminar y su posible modo de acción. Seis cepas produjeron toxinas killer en ensayos en medio YPD-MB y fueron resistentes a las toxinas producidas por las otras cinco, indicando que podría tratarse del mismo tipo de toxina denominada SeKT. Se seleccionó la cepa productora NPCC 1302 y su producción se optimizó mediante un Diseño Estadístico Experimental (DEE) utilizando medio YPD (pH 4,5) con diferentes condiciones de agitación, temperatura, concentraciónnde tritón y glicerol. El extracto crudo de toxina se obtuvo por precipitación con sulfato de amonio 80% p/v, centrifugación seguida de diálisis en buffer citrato-fosfato 0,1M pH 4,5 y concentración con azúcar. La determinación cuantitativa de la actividad killer se realizó por medición de DO 630 nm a las 48h a 20°C en medio líquido (YPD), utilizando Candida glabrata NPCC 106 como levadura sensible. El peso molecular de SeKT se estimó por filtración con membranas de diferente cut-off. La actividad beta-glucanasa se cuantificó utilizando p-nitrofenolglucósido como sustrato. Se determinó el blanco en la pared celular por competencia con polimeros: laminarina, pustulano, pululano, Concanavalina A, curdlano, manano y quitina. Se determinaron los efectos de SeKT a nivel subcelular sobre C. glabrata por microscopía de fluorescencia, empleando tinción doble con Ioduro de Propidio y Hoechst 33342 para evaluar muerte celular. La condición óptima de produccion de SeKT por el DEE fue: YPD con 0,1% v/v de tritón y 5% v/v de glicerol, 13°C y 120 rpm. La síntesis de SeTK se observó antes del inicio de la fase estacionaria de crecimiento, el peso molecular fue mayor a 30KDa y presentó actividad beta-glucanasa. SeTK fue además capaz de inhibir el crecimiento de Brettanomyces bruxellensis NPCC 114, especie contaminante de vinos. Los resultados obtenidos frente a polimeros de pared, indicarían que los blancos primarios podrían ser los glucanos (manano, laminarina y curdulano) y la quitina, ya que su actividad killer disminuyó en presencia de estos compuestos en el medio. En cuanto al mecanismo de accion subcelular, los resultados indican un máximo de acción a las 3hs, donde más del 90% de células presentan núcleos anormales con condensación y fragmentación del ADN y un 70% de las mismas muestran pérdida de la integridad de la membrana. A las 24 y 48hs todas las células muertas presentan características apoptóticas evidenciando una continuidad del proceso de muerte.