CDKA y ciclina D6 de maíz: clonado y producción de proteína recombinante

ME VINACOUR; CL MATAYOSHI; AAE MÉNDEZ; NM GOMEZ MANSUR; LB PENA; E GARCÍA-RAMÍREZ; JM VÁZQUEZ-RAMOS; SM GALLEGO

San Miguel de Tucumán

Congreso; X Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO Argentina 2015; 2015

REDBIO

La disminución del crecimiento vegetal es uno de los principales síntomas visibles en plantas sometidas a condiciones ambientales desfavorables, pudiendo afectar la supervivencia y/o la productividad de las mismas. Dentro de los factores que rigen el crecimiento se encuentra la proliferación, proceso conducido por el ciclo celular, cuya bioquímica depende de la actividad de kinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y de sus activadores específicos, las ciclinas. Los complejos formados entre la CDKA y las ciclinas de tipo D (CycD) son responsables de la transición G1-S que pone en marcha la división celular. En nuestro laboratorio demostramos que varios factores abióticos pueden alterar el equilibrio redox celular conduciendo a la generación de estrés oxidativo. En particular, asociamos las modificaciones postraduccionales (MPT) de tipo oxidativas de las proteínas CDKA y CycD con interrupción de la fase G1-S como parte del mecanismo de detención del crecimiento vegetal. El objetivo de nuestra investigación es estudiar la sensibilidad y/o sitios posibles de sufrir MPT oxidativas de la CDKA y las CycD para poder evaluar si estas MPT alteran la interacción CDKA/CycD o modifican sitios blanco de otras MPT. En este trabajo presentamos resultados bioinformáticos y el comienzo de la optimización de la producción de proteínas recombinantes. Para ello, a partir de ARNm obtenido de ejes embrionarios de maíz (Zea mays L.) variedad Chalqueño, se clonaron las secuencias codificantes de CDKA y de CycD6 en pGEX-4T2, que luego fueron introducidos en Escherichia coli cepa BL21. Las secuencias clonadas se controlaron por secuenciación por electroforesis capilar. Mediante análisis bioinformáticos se compararon las secuencias codificantes (nucleótidos y aminoácidos) de referencia y clonadas, se realizaron predicciones de dominios (http://www.ebi.ac.uk/interpro/), de MPT (http://www.expasy.org/), estructura secundaria y terciaria donde se ubicaron aminoácidos susceptibles a oxidación (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2). Con el fin de optimizar la producción de proteína se compararon producciones en la cepa BL21 y en la cepa Rosetta gami(DE3)pLysS en medio de cultivo Luria-Bertani (LB), siendo BL21 la cepa elegida para producir CDKA y Rosetta para la producción de CycD6. El uso de 2xLB no mejoró la producción de proteína, al igual que el enriquecimiento del medio de cultivo con dos fuentes de C diferentes: glucosa y glicerol. No se detectó fragmentación de las proteínas, tanto por proteasas como por el proceso de congelado/descongelado. Si bien parte de la producción bacteriana se encuentra en forma soluble en el citoplasma celular, una gran cantidad de proteína permanece formando parte de cuerpos de inclusión, por este motivo fue necesario la recuperación de las proteínas de los mismos.Entendemos que comprender los mecanismos que alteran la funcionalidad de proteínas implicadas en el crecimiento vegetal nos permitirá mejorar la comprensión de los procesos que comunican la maquinaria del ciclo celular con las señales internas de la célula y los agentes externos, aportando al conocimiento de los mecanismos que alteran el crecimiento de las plantas y abriendo nuevas perspectivas en la selección e ingeniería de plantas para mejorar los cultivos de interés agroalimentario.