Uso de las técnicas MSp·PCR y RFLP-ITS para la identificación de levaduras fermentadoras asociadas a Cyttaria hariotii.

R. ULLOA; D. LIBKIND; S. FONTENLA; C. A. LOPES; M. VAN BROOCK

Córdoba

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007

Asociación Argentina de Microbiología

El estudio convencional de levaduras de ambientes naturales implica numerosos aislamientos y su posterior caracterización e identificación es tediosa y en general poco efectiva. La identificación precisa de levaduras a nivel de especie requiere el uso de técnicas de biología molecular, en particular de secuenciación del ADNr. En este trabajo se aplicó el uso combinado de 2 técnicas moleculares: MSP-PCR y RFLP-ITS, para la identiticación de levaduras fermentadoras asociadas al estroma de Cyttaria hariotti - hongo parásito de árboles del género Nothofagus - del Parque Nacional Nahuel Huapi, Patagonia, Argentina. Se obtuvieron 72 aislamientos de levaduras fermentadoras utilizando un medio de cultivo selectivo con etanol. Los aislamientosfueron caracterizados con la técnica de MSP-PCR fingerprinting empleando los cebadores M13, (GAC)5 y (GTG)5; en base a la similitud de los perfiles de bandas obtenidos los aislamientos fueron clasificados en 10 grupos (Gl a G 1O). Algunos aislamientos representativos de cada grupo fueron estudiados mediante la técnica RFLP-ITS. El tamaño del fragmento ITS para los grupos G 1 a G4 tue de 850 pb, tamaño caracteristico de Saccharomyces "sensu stricto". Los restantes grupos presentaron tamaños menores de ITS que oscilaron entre 460 y 750 pb. La especie S. cerevisiae se encontró en (G3) y un segundo conjunto que abarca los Gl, G2 Y G4; identificados como S. bayanus ó S. uvarum. Entre los grupos no sacaromicéticos se reconocieron a las especies Zigosaccharomyces cidri (G7) y Pichia delftensis (G8 y G9)  mientras que no fue posible identificar las especies comprendidas en los grupos G5, G6 Y G 1O. Para confirmar las identificaciones obtenidas por RFLP-ITS se procedió a la secuenciación de las regiones Dl/D2 e ITS del ADNr 26S. Dentro de los grupos sacaromicéticos, se observó que G1 Y G4 correspondieron a S. uvarum y G2 a S. bayanus. Se confirmaron las  identificacione& RFLP-iTS para los grupos no-sacaromiceticos, pudiendo detectar 3 especies nuevas de los géneros,Hanseniaspora y Candida. CONCLUSION: La técnica de MSP-PCR permitió el rápido agrupamiento de los aislamientos co-especificos siendo el cebador M13 el que ofreció una mejor diferenciación de los grupos. El uso de la técnica RFLP-ITS permitió una correcta identificación de los aislamientos, permitiendo en la mayoría de los casos prescindir de la secuenciación. El uso combinado de las técnicas MSP-PCR y RFLP-ITS se muestra como una herramienta eficaz para el estudio de la biodiversidad de levadurlls en ambientes naturales.