INVESTIGADORES
LOPES christian ariel
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización preliminar de dos toxinas killer para el biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
Autor/es:
SÁEZ J.S.; VILLALBA L.; DEL MÓNACO S.; LOPES C.A.; SANGORRIN M.P.
Lugar:
Mendoza
Reunión:
Jornada; III Jornadas Nacionales de Biología y Biotecnología de Levaduras; 2011
Resumen:
En nuestro laboratorio se han seleccionado dos cepas de levadurasproductoras de toxinas killer pertenecientes a las especies Torulasporadelbrueckii (toxina TdKT) y Wickerhanomyces anomala (toxina WaKT) capacesde combatir el desarrollo, en ensayos de laboratorio, de levadurascontaminantes de vinos: Brettanomyces bruxellensis, Pichia guilliermondii,Pichia manshurica y Pichia membranifaciens, todas ellas productoras deniveles significativos de fenoles volátiles.Las toxinas TdKT y WaKT se obtuvieron a partir del sobrenadante de uncultivo en fase estacionaria en medio YPD, que fue precipitado con 80% desulfato de amonio. Para la detección de las toxinas se utilizó una cepa sensiblecontrol de Candida glabrata, analizando los halos de inhibición del crecimientoen medio YPD-MB-agar, el seguimiento de DO 650 en microplacas de 96pocillos con caldo YPD y la viabilidad mediante ensayos de MTT.Se evaluó la estabilidad de las toxinas frente a diferentes condiciones destress típicas de vinificación (pH, etanol, temperatura y dióxido de azufre).Ambas fueron estables a etanol 2-16%, temperatura 0-26°C, pH 3-4,5 y SO225-150 ppm, resultando interesantes para su empleo en vinificación. A su vez,las toxinas mostraron diferente especificidad frente a las levadurascontaminantes. WaKT fue más efectiva frente a P. guilliermondii y P.membranifaciens, mientras que TdKT lo fue frente a P. guilliermondii, P.manshurica y B. bruxellensis.Se determinó que la masa molecular de las dos toxinas es mayor a 30KDa por filtración diferencial con membranas de diferente cut-off. Para conocerel blanco primario de las toxinas se realizaron ensayos de competencia enplacas con YPD-MB-agar, con diferentes polisacáridos de la pared delevaduras: curdulano, laminarina, manano, pustulano, pululano y quitina, comotambién con la lectina ConA. El pustulano (β-1,6-glucano) logró reducir laactividad de las dos toxinas. Adicionalmente, la lectina redujo la actividad deTdKT, indicando que las mananoproteínas son también un blanco para lamisma.Para conocer el modo de acción de las toxinas se utilizaron técnicas demicroscopía de fluorescencia que incluyeron tinción con Calcofluor White,ioduro de propidio, y Hoechst 33342. Los ensayos demostraron que ambastoxinas inducen procesos apoptóticos en las levaduras sensibles, afectando laviabilidad celular significativamente a partir de las 24 hs.Los resultados obtenidos permiten inferir el uso potencial de ambas toxinaskiller en enología con el fin de lograr vinos sin defectos y con menores riesgospara la salud al disminuir la utilización de conservantes químicos.