INVESTIGADORES
IBAÑEZ Lorena Itati
congresos y reuniones científicas
Título:
Selección y caracterización de nanoanticuerpos específicos contra la proteína NS1 del virus del dengue con aplicación al desarrollo de pruebas diagnósticas
Autor/es:
MALNERO, C; IDROVO, T; MALIRAT, V; IBAÑEZ, LI
Lugar:
Vaquerías Córdoba
Reunión:
Congreso; XXXIX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA; 2019
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virologia - SAV
Resumen:
El dengue es la principal enfermedad viral transmitida por mosquitos, siendo endémica en más de 100 países. Se estima que se producen aproximadamente 390 millones de infecciones en el mundo por año. En Argentina la mayor epidemia se produjo en el año 2016, con más de 40.000 casos confirmados y 10 fallecimientos. Teniendo en cuenta el impacto socio-económico que tiene la enfermedad, es de gran interés desarrollar métodos de diagnóstico y prevención eficaces. Uno de los principales biomarcadores de infección con el virus del dengue (DENV), es la proteína viral NS1. Se trata de una glicoproteína multifuncional de entre 45-60 KDa que es secretada al torrente sanguíneo. Actualmente el diagnóstico clínico basado en la detección de esta proteína se realiza mediante kits comerciales importados con un costo muy elevado. En este sentido, la utilización de nanoanticuerpos es una alternativa interesante frente a los kits disponibles basados en anticuerpos monoclonales, dado su menor costo y mayor estabilidad. El presente trabajo tiene como objetivo la selección y caracterización de nanoanticuerpos específicos contra la proteína NS1 del DENV con aplicación al desarrollo de pruebas diagnósticas. Una biblioteca de nanoanticuerpos fue previamente obtenida en el laboratorio mediante la inmunización de dos llamas con sobrenadante de células Vero infectadas con los cuatro serotipos del DENV. Para lo cual, las regiones variables de los anticuerpos de cadena pesada fueron clonadas en un vector fagémido (pHEN4) y posteriormente bacterias E. Coli TG1 fueron transformadas con la construcción. Fagos recombinantes fueron obtenidos mediante infección de las bacterias transformadas con fago helper VSCM13 y a continuación seleccionados por bio-panning en fase sólida. Se utilizaron dos estrategias para la selección. La primera mediante la utilización de la proteína recombinante NS1 (rNS1) del DENV serotipo 1 expresada en células HEK293T y purificada. La segunda con células Vero transfectadas para expresar la rNS1 del DENV serotipo 2. En ambos casos se logró un buen enriquecimiento. 96 clones fueron aislados en placas de cultivo de medio sólido y su reactividad contra rNS1 de serotipos 1, 2 y 3 fue testeada por ELISA de fagos. Así mismo se generaron perfiles de restricción con HinfI para estimar la heterogeneidad de los mismos. En base a estos dos últimos análisis 18 clones fueron secuenciados, siendo identificados 10 nanoanticuerpos diferentes.Finalmente estos nanoanticuerpos fueron expresados en el periplasma bacteriano y su especificidad fue evaluada contra las proteínas rNS1 de DENV (serotipo 1 y 2) y del virus del Zika (ZIKV) por ELISA indirecto. Todos los clones ensayados tuvieron reactividad contra ambas rNS1 de DENV y no presentaron cross-reactividad con la proteína de ZIKV.En conclusión se logró seleccionar nanoanticuerpos con reactividad específica contra la proteína NS1 del DENV con potencial aplicación al desarrollo de kits diagnósticos de origen nacional y menores costos que los disponibles en el mercado.