Obtención y caracterización de Nanoanticuerpos como potenciales antivirales.

PAREDES ROJAS YESICA; CALDEVILLA CECILIA; MATTION NORA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Otro; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología.; 2016

Introducción: A finales de ladécada del 80, una observación sorprendente informó de la existencia de anticuerpos no convencionales en miembros de la familia Camelidae. Estos anticuerpos carecían de la  cadena  liviana y  de  un dominio  constante  de la  cadena  pesada. Cuando  se  expresó el  único dominio  variable, que  recibió  el nombre  de  Nanoanticuerpo  (NanoAc), se  observó  que  el  mismo conservaba  una fuerte  especificidad  y afinidad  hacia  antígenos; era  soluble  en medio  acuoso  y resistente a  varios  pHs y  temperaturas;  podía reconocer  epítopes  poco accesibles;  se  expresaba fácilmente en microorganismos y podía ser modificado mediante técnicas de ingeniería genética para mejorar suspropiedades. Hasta el momento se ha reportado el uso exitoso de NanoAcs para inhibir y detectar  varios  tipos de  virus  como VIH,  HBV,  Influenza, RSV,  Rabia,  FMDV, Poliovirus,  Rotavirus, vaccinia,  entre otros. En este trabajo reportamos los resultados de  la construcción de una biblioteca de NanoAcs contra la región del tallo de la proteína HA del virus de influenza y de la proteína E del virus del Dengue (DENV). Materiales y métodos: Dos llamas fueron inmunizadas con proteína recombinante DHA que expresa la región del tallo de los virus de influenza H5N1 y H3N8; y con virus del Dengue purificado e inactivado de los serotipos DENV-1 a 4. Una vez alcanzada una buena respuesta inmune, medida por la técnica de ELISA, los animales fueron sangrados y seextrajo ARN de los linfocitos. Se preparó ADNc y  se  realizaron dos  PCRs  para clonar  los  genes de  inmunoglobulinas,  la última  con oligonucleótidos  que permitieron  ligar  los fragmentos  obtenidos  en el  vector  fagémido pHEN4. Bacterias  TG1  fueron transformadas  con  la ligación  y  se obtuvo  una  biblioteca representativa  del repertorio  de genes  de  cada llama.  Posteriormente  se construyó  una  biblioteca de  fagos  que  seseleccionaron  mediante  un procedimiento  de  biopanning. Desde  clones  positivos se  produjeron extractos de periplasma cuya especificidad hacia las proteínas en estudio se analizó mediante ELISA. La variabilidad dentro de los mismos fue demostrada por Colony PCRy digestión con enzima HinfI. Resultados: Se obtuvieron NanoAcs que reconocen de manera específica la región del tallo de la HA, los  mismos fueron  expresados  y caracterizados  por  ELISA. También  se  obtuvieron NanoAcs  con capacidad de unión específica a la proteína E de los cuatro serotipos de DENV. Conclusiones: Hasta el momento hemos obtenido NanoAcs específicos contra H3 y H5 del virus de influenza.  Los mismos  se  caracterizarán  como potenciales  moléculas  para inhibir  la  infección por diferentes serotipos del virus tanto in vitro como in vivo. Respectoa los NanoAcs contra la proteína E de DENV, se espera poder expresar ycaracterizar los mismos mediante técnicas ya establecidas en el  laboratorio. En  un  futuro se  analizará  su potencial  aplicación  como antivirales  o moléculas  que permitan dirigir antivirales hacia células infectadas con DENV.