INVESTIGADORES
IBAÑEZ Lorena Itati
congresos y reuniones científicas
Título:
Establecimiento de una plataforma de producción de Nanoanticuerpos. Prueba de concepto: generación de moléculas para neutralización de Influenza y detección del virus de Dengue
Autor/es:
PAREDES ROJAS YESICA; CALDEVILLA CECILIA; RIVA DIEGO ARIEL; MATTION NORA; GARCÍA, CYBELE; IBAÑEZ, LORENA ITATÍ
Lugar:
Rosario, Santa Fe
Reunión:
Congreso; XXIII congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016
Resumen:
Introducción: A finales de la década del 80, una observación sorprendente informó de la existencia de anticuerpos no convencionales en miembros de la familia Camelidae.Estos anticuerpos carecían de la cadena liviana y de un dominio constante de la cadena pesada. Cuando se expresó el único dominio variable, que recibió el nombre de Nanoanticuerpos (NanoAc), se observó que el mismo conservaba una fuerte especificidad y afinidad hacia antígenos; era soluble en medio acuoso y resistente a varios pHs y temperaturas; podía reconocer epítopes poco accesibles; se expresaba fácilmente en microorganismos y podía ser modificado mediante técnicas de ingeniería genética para mejorar sus propiedades. Hasta el momento se ha reportado el uso exitoso de NanoAcs para inhibir y detectar varios tipos de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV, Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, vaccinia, entre otros. En este trabajo reportamos los resultados dela construcción de una biblioteca de NanoAcs contra la región del tallo de la proteína HA del virus de influenza y de la proteína E del virus del Dengue(DENV). Materiales y Métodos: Dos llamas fueron inmunizadas con proteína recombinante DHA, que expresa la región del tallo de los virus de influenza H5N1 y H3N8; y con virus del Dengue purificado einactivado de los serotipos DENV-1 a 4. Una vez alcanzada una buena respuestainmune, medida por la técnica de ELISA, los animales fueron sangrados y se extrajo ARN de los linfocitos. Se preparó ADNc y se realizaron dos PCRs para clonar los genes de inmunoglobulinas, la última con oligonucleótidos que permitieron ligar los fragmentos obtenidos en el vector fagémido pHEN4. Bacterias TG1 fueron transformadas con la ligación y se obtuvo una biblioteca representativa del repertorio de genes de cada llama. Posteriormente seconstruyó una biblioteca de fagos que se seleccionaron mediante un procedimiento de biopanning. Desde clones positivos se produjeron extractos de periplasma cuya especificidad hacia las proteínas en estudio se analizó mediante ELISA. La variabilidad dentro de los mismos fue demostrada por ColonyPCR y digestión con enzima HinfI. Resultados: Se obtuvieron NanoAcs que reconocen de manera específica la región del tallo de la HA, los mismos fueron expresados y caracterizados por ELISA. También se obtuvieron NanoAcs con capacidad de unión específica a la proteína E de los cuatro serotipos de DENV.Conclusiones: Hasta el momento hemosobtenido NanoAcs específicos contra H3 y H5 del virus de influenza. Los mismos se caracterizarán como potenciales moléculas para inhibir la infección por diferentes serotipos del virus tanto in vitro como in vivo. Respecto  alos NanoAcs contra la proteína E de DENV, se espera poder expresar y caracterizar los mismos mediante técnicas ya establecidas en el laboratorio. En un futuro se analizará su potencial aplicación como antivirales o moléculas que permitan dirigir antivirales hacia células infectadas con DENV.