Generación de una biblioteca de Nanoanticuerpos para la obtención de moléculas neutralizantes del virus de Influenza y la detección de virus del Dengue.

PAREDES ROJAS YESICA; CALDEVILLA CECILIA; RIVA DIEGO ARIEL ; MATTION NORA; GARCÍA, CYBELE; IBAÑEZ LORENA ITATÍ

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología - II Congreso Latinoamericano de Virología-IV Simposio de Virología Clínica - II Simposio de Virología Veterinaria Dr. José L. La Torre; 2015

En 1993 una observación sorprendenteinformó de la existencia de anticuerpos no convencionales en miembros de la familiaCamelidae. Estos anticuerpos carecíande la cadena liviana y de un dominio constante de la cadena pesada. Cuando seexpresó el único dominio variable, que recibió el nombre de Nanoanticuerpo(NanoAc), se observó que el mismo conservaba una fuerte especificidad yafinidad hacia el antígeno; era soluble en medio acuoso y resistente a variospHs y temperaturas; podía reconocer epítopes poco accesibles; se expresabafácilmente en microorganismos y podía ser modificado mediante técnicas deingeniería genética para mejorar sus propiedades. Hasta el momento se hareportado el uso exitoso de NanoAcs para inhibir y detectar varios tipos devirus como VIH, HBV, Influenza, RSV, Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus,vaccinia, entre otros. En este trabajo reportamos los resultados de laconstrucción de una biblioteca de NanoAcs contra la región del tallo de laproteína HA del virus de influenza y de la proteína E del virus del Dengue(DENV). Dos llamas fueron inmunizadas con cincoinmunizaciones de 50 mg de proteína HA recombinante deinfluenza, de los subtipos H5N1 y H3N8, y 100 mg de virus delDengue purificado e inactivado de los serotipos DENV-1 (cepa HW); DENV-2 (cepaNGC), DENV-3 (cepa Philippines/H87/1956) y DENV-4 (aislamiento 8124). Larespuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 se determinó luegode cada inmunización utilizando anticuerpos específicos mediante la técnica deELISA. Una vez alcanzada una buena respuesta inmune, los animales fueronsangrados y se extrajo ARN de los linfocitos aislados. Se preparó ADNc y serealizaron dos PCR para clonar los genes de inmunoglobulinas, la última con oligonucleótidosque permitieron ligar los fragmentos obtenidos en el vector fagémido pHEN4.Bacterias TG1 fueron transformadas con la ligación y se obtuvo una bibliotecarepresentativa del repertorio de genes de cada llama.Los resultados de los ELISAs indicaronque ambas llamas fueron efectivamente inmunizadas. La respuesta inmune fueelevada contra los cuatro serotipos de DENV. La respuesta contra HA de influenzafue menor, por lo que fueron necesarias nuevas inmunizaciones. Las PCRsrealizadas para clonar el repertorio de genes permitieron obtener inicialmentebandas correspondientes a las regiones variables de los anticuerposconvencionales y no convencionales. La segunda PCR permitió aislar únicamentelos fragmentos provenientes de los anticuerpos no convencionales, que son losque dan lugar a los NanoAcs. Posteriormente, se prepararon bacterias TG1competentes de alta eficiencia que permitieron generar una biblioteca de genes deinmunoglobulinas. Bacterias conteniendo los vectores fagémidos serán infectadascon un fago helper para producir fagosque expresen los NanoAcs. Mediante un procedimiento de biopanning se espera seleccionar NanoAcs que tengan propiedades deunión específica contra las proteínas inoculadas.