INVESTIGADORES
IBAÑEZ Lorena Itati
congresos y reuniones científicas
Título:
Genética reversa aplicada a la generación y caracterización de un virus de Influenza A de perdiz
Autor/es:
PAREDES ROJAS YESICA; CALDEVILLA CECILIA; MATIELLO ROSANA; MATTION NORA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XXXIII Reunión Científica Anual- Sociedad Argentina de Virología; 2013
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
Introducción: En el año 2008 se aisló
un virus de influenza H1N1 en perdices coloradas provenientes de la provincia
de Buenos Aires. Este virus denominado A/red-winged tinamou/Argentina/MP1/2008
fue secuenciado parcialmente y presenta interesantes características
moleculares, las cuales no han sido estudiadas en profundidad. El sistema de
genética reversa es ampliamente utilizado para el estudio de nuevas cepas de
influenza. El más conocido se basa en el uso de 8 plásmidos obtenidos a partir
del vector pHW2000, el cual permite clonar el cADN viral entre un promotor de
la ARNpol I en un sentido y el de la ARNpol II en el sentido inverso, para
obtener vARN y mARN desde el mismo templado. Además, por la estrategia de
clonado aplicada, permiten trabajar con virus cuyas secuencias de genes son
desconocidas.
Objetivos: El objetivo de este
trabajo fue obtener los 8 segmentos del virus de perdiz mediante genética reversa
con el fin de generar partículas virales infecciosas que puedan ser fácilmente
caracterizadas a nivel molecular.
Materiales y Métodos: Para llevar a cabo este
proyecto se puso a punto en el laboratorio la técnica de genética reversa
basada en 8 plásmidos. El paso inicial fue retro-transcribir la información
genética del virus utilizando un primer
universal. Posteriormente se realizó una reacción de PCR utilizando primers que reconocen regiones dentro de
las secuencias no codificantes del virus. Los fragmentos específicos obtenidos
fueron usados como megaprimers en una
segunda reacción de PCR. Dicha reacción fue posteriormente tratada con la
enzima DpnI con el fin de eliminar las secuencias parentales que sirvieron de
templado y finalmente fue transformada en bacterias DH5alfa. Las colonias
obtenidas fueron analizadas con la enzima BglI para poder identificar colonias
que contenían el inserto incorporado.
Resultados: Se puso a punto la
reacción de retro-transcripción utilizando un buffer específico para secuencias ricas en GC y el primer universal
uni12. La primera reacción de PCR dio como resultado los 8 fragmentos
esperados, inclusive fragmentos de más de 2000 pares de bases correspondientes
a las polimerasas virales. La reacción de PCR basada en megaprimers se realizó con éxito para el fragmento correspondiente
a la HA viral, la cual luego del tratamiento con BglI dio como resultado el
patrón de restricción esperado. Actualmente se está avanzando en el clonado de
los genes NS, NA, NP y M.
Conclusiones: Se puso a punto un
sistema de genética reversa que permitirá caracterizar el genoma del virus de
perdiz utilizando técnicas como mutagénesis dirigida o intercambio de segmentos
genómicos. Hasta el momento se ha clonado el fragmento correspondiente a la HA.
Se espera clonar los fragmentos restantes para poder generar virus infectivo,
lo que permitirá avanzar con el objetivo de caracterizar molecularmente este
patógeno aviario y obtener en un futuro antivirales que permitan la inhibición
de la infección provocada por el mismo.
