DISEÑO Y EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES PARA USO PREVENTIVO DE INFECCIONES CON EL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA

CALDEVILLA CECILIA; PAREDES ROJAS YESICA; OUSSET JULIA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ; MATTION NORA

Buenos Aires

Congreso; XXXIII Reunión Científica Anual- Sociedad Argentina de Virología; 2013

Asociación Argentina de Microbiología

Introducción: La influenza equina (IE) es una enfermedad infecciosa causada por el virus influenza tipo A. Este virus es altamente contagioso y la IE es considerada una enfermedad respiratoria de gran importancia económica en las poblaciones equinas. La hemaglutinina (HA) es la principal proteína de la envoltura viral einduce anticuerpos capaces de neutralizar la entrada del virus a la célula. Sin embargo, debido a su alta variabilidad antigénica genera baja reactividad inmune cruzada. Trabajos recientes demuestran la existencia en la HA de epitopes neutralizantes altamente conservados entre las distintas cepas de influenza ubicados en la región del tallo de la proteína, especialmente en el dominio HA2, y que pueden ser utilizados para mejorar dicha respuesta. Objetivo: Diseñar y generar dos inmunógenos basados en la HA viral tipo A/H3 equina que se utilizarán como vacunas. El primero será una proteína recombinante expresada en células procariotas (HAcoli). El segundo será una secuencia de ADN que se expresará en células eucariotas (ΔHA-GCN4). Dichas moléculas contienen solamente la región del tallo de la HA equina y exponen el dominio conservado HA2 que no se encuentra accesible en la proteína nativa. Con esta estrategia se desea aumentar la reactividad inmune cruzada inducida por estos inmunógenos contra diferentes cepas de virus equinos. Metodología: La secuencia que codifica para HAcoli (H3N8) (A/Equi/Argentina/93) fue clonada en el vector pET22b y transformada en células BL21. Se desarrollaron ensayos de inducción con diferentes concentraciones de IPTG a distintos tiempos, temperaturas y medios de cultivo. Por otro lado, la secuencia ΔHA-GCN4 fue subclonada en dos vectores para expresión, pCI-neo y pCDNA4HisMaxC que fueron transfectados en células HEK 293T por el método de fosfato de calcio. La expresión de ambas proteína se analizó mediante SDS-PAGE y western blot. Resultados: Se demostró la expresión de HAcoli (33 KDa) mediante SDS-PAGE y su identidad fue confirmada por WB. No se observaron diferencias en los niveles de expresión a distintas concentraciones de IPTG y la proteína recombinante se obtuvo a partir de la fracción insoluble. Por otro lado, se confirmó la expresión de ΔHA-GCN4 en células eucariotas con ambos vectores de expresión. Conclusiones: Se logró optimizar la expresión de la HA del virus de influenza equina, tanto en su versión optimizada para expresión en E.coli como en su forma optimizada para expresión en células eucariotas. Se espera poner a punto los ensayos de purificación de HAcoli desde cuerpos de inclusión, para posteriormente ser utilizada como vacuna a proteína recombinante. Por otro lado se espera obtener plásmido libre de LPS en el caso de la construcción ΔHA-GCN4, la cual será utilizada como vacuna a ADN. Posteriormente, se inmunizarán ratones y se evaluará la capacidad de dichas vacunas para otorgar protección cruzada y prevenir la infección con virus de influenza pertenecientes a distintos serotipos.