DISEÑO Y EXPRESIÓN DE UN INMUNOGENO BASADO EN LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA

CALDEVILLA CECILIA; PAREDES ROJAS YESICA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ; MATTION NORA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; Congreso Argentino de Microbiología; 2013

DISEÑO Y EXPRESIÓN DE UN INMUNOGENO BASADO EN LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA Caldevilla C., Paredes Rojas Y., Ibañez I., Mattion N. Introducción: la influenza equina (IE) es una enfermedad infecciosa causada por el virus influenza tipo A. Este virus es altamente contagioso y la IE es considerada como la enfermedad respiratoria de mayor importancia económica en las poblaciones equinas. La hemaglutinina (HA) es la principal proteína de la envoltura viral e induce anticuerpos capaces de neutralizar la entrada del virus a la célula. Sin embargo, debido a su alta variabilidad antigénica genera baja reactividad cruzada. Trabajos recientes demuestran la existencia en la HA de epitopes neutralizantes altamente conservados entre las distintas cepas de influenza ubicados en la región del tallo de la proteína, especialmente en el dominio HA2, y que pueden ser utilizados para mejorar la reactividad cruzada. Objetivo: diseñar y generar una molécula que contenga solamente la región del tallo de la HA equina, de manera de exponer el dominio conservado HA2 que no se encuentra accesible en la proteína nativa. Expresar dicha proteína y utilizarla como inmunógeno para determinar reactividad cruzada contra diferentes cepas de virus equinos y utilizar la secuencia de nucleótidos para generar una vacuna a ADN. Materiales y Métodos: la secuencia que codifica para HA (H3N8) (A/Equi/Argentina/93) optimizada para su expresión en E.coli, fue clonada en el vector pET22b. La inducción de la expresión de la proteína se realizó a diferentes concentraciones de IPTG y fue evaluada a distintos tiempos, temperaturas y medios de cultivo. La expresión en las fracciones se analizó mediante SDS-PAGE y western blot. Por otro lado, la secuencia fue subclonada en un vector para expresión en eucariotas que fue transfectado en células HEK293 para posteriormente detectar su expresión mediante western blot. Resultados: Se demostró la expresión de una proteína de 33 KDa mediante SDS-PAGE y luego su identidad fue confirmada por WB. El tiempo óptimo para la expresión de la proteína fue entre las 3 y 7 h post inducción, no observándose expresión luego de una inducción over night. La proteína recombinante se obtuvo a partir de la fracción insoluble y los mayores niveles de expresión se alcanzaron con el medio Terrific Broth, a 37°C. No se observaron diferencias en los niveles de expresión a distintas concentraciones de IPTG. La expresión en células eucariotas presentó varios problemas, que estarían relacionados con la falta del dominio globular que dificulta su expresión. Conclusiones: se logró optimizar la expresión de la proteína variando las condiciones de concentración de IPTG, tiempo de inducción, temperatura y medio de cultivo. Para solucionar los problemas relacionados con la falta de expresión de la proteína en células eucariotas se están probando nuevas estrategias, como la generación de proteínas quiméricas que facilitarían la expresión por formación de trímeros.