Uso de vectores amplicón derivados de HSV-1 para sobreexpresión y silenciamiento por RNAi de canalesde calcio de tipo P/Q

LORENA ITATÍ IBAÑEZ; MARIANO NICOLÁS DI GUILMI ; OSVADO UCHITEL

Los Cocos, Córdoba, Argentina

Congreso; XXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Neurociencias; 2007

Los canales de calcio activados por voltaje (CCAV) acoplan cambios en el potencial de membrana a funciones neuronales reguladas por calcio incluyendo liberación de neurotransmisores. Para analizar la participación de los distintos CCAV en la neurotransmisión, es interesante poder modular la expresión de los mismos, para este fin se pueden utilizar vectores amplicón derivados de HSV-1. En nuestro laboratorio contamos con este tipo de vectores que según su diseño permiten la sobreexpresión de canales P/Q (v-P/Q), o el silenciamiento de este gen por medio de siRNAs (v-siRNA).En este trabajo presentamos experimentos realizados en la línea celular PC12 que expresa diferentes CCAV y cuya electrofisiología es conocida. Para los experimentos de interferencia se diseñaron oligonucleótidos que reconocen tres regiones distintas del gen de canal P/Q, como así también una secuencia random usada como control. En los experimentos de sobreexpresión se usó una secuencia que codifica para el canal P/Q humano.Usando PCR en tiempo real detectamos la expresión del canal P/Q en células infectadas con v-P/Q, la expresión de la proteína se determinó por western e inmunofluorecencia. Luego de aplicar toxinas específicas contra diferentes canales, no se observó un claro aumento en el porcentaje de la corriente P/Q respecto a los controles.La capacidad de silenciamiento de las distintas secuencias fue testeada por PCR en tiempo real y western. En células infectadas se observaron corrientes de calcio mayores a los controles, principalmente de tipo N y L, esto sugeriría la existencia de un mecanismo compensatorio. En algunos casos no hubo efecto de la toxina contra canal P/Q lo que indicaría disminución de la expresión de este canal.