AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN POR RT-PCR Y RFLP, DE CANINE DISTEMPER VIRUS (CDV) EN PERROS DE LA CIUDAD DE BS AS. II: ANÁLISIS DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA Y AMINOACIDICA DEL GEN DE LA HEMAGLUTININA

GALLO CALDERON, MARINA; REMORINI, PATRICIA; IGLESIAS, MARCELA; PERIOLO, OSVALDO; LA TORRE, JOSE

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virologia; 2005

Sociedad Argentina de Virologia

El CDV es uno de los agentes infecciosos más importantes de cánidos y otros carnívoros salvajes. La enfermedad se previene con vacunación; generalmente con vacunas a virus vivo modificado (VVM) que fueron desarrolladas en la década del ´60 y generalmente, no actualizadas. Por otro lado, recientemente se han registrado casos de perros infectados en poblaciones de animales vacunados, que podrían explicarse por un déficit en el nivel de protección de las vacunas. Se sugiere que estos casos, estarían relacionados con modificaciones genéticas y antigénicas de los virus de campo ocurridas desde entonces. Datos inmunológicos y moleculares demostraron que el gen de la Hemaglutinina (H) es la región del genoma viral que presenta mayor variabilidad, por lo tanto, el objetivo de este estudio es el análisis molecular de esta zona. OBJETIVO: Identificación y caracterización de las cepas de CDV circulantes en la Ciudad de Buenos Aires (CBA) en base a un diagnóstico rápido por RT-PCR y al estudio de las secuencias de un fragmento del gen de la H, utilizando como referencia cepas vacunales y virulentas aisladas en USA, Europa y Japón. Materiales y Métodos:Se amplificaron los ARNs provenientes de:1) muestras de sangre de animales con sintomatología compatible con CDV. 2) vacunas comerciales de Argentina. 3) cepa Lederle, utilizada como vacuna en el pasado.Se analizaron 99 muestras de las cuales, 72 presentaron amplificación positiva por RT-PCR, para el gen de la nucleoproteína, confirmando el diagnóstico de CDV. De las 72 muestras positivas, sólo en 23, se logró amplificar un fragmento de 871 pares de bases (pb) de la H. Este fragmento, se utilizó para estudios de RFLP con la endonucleasa NdeI y por otro lado, se clonó en el plásmido pGEM®-T Easy Vector. Los clones positivos, se secuenciaron según la metodología de “single extensión” en ambas direcciones 5´y 3´. Las secuencias se analizaron utilizando los programas Clustal W y Phylip-3.63 CONCLUSIONES: ANALISIS POR RFLP: los aislamientos de la CBA, presentan un sitio de corte para la enzima NdeI obteniéndose un perfil de 2 fragmentos: uno de 661 y otro de 210 pb. La cepa LEDERLE, presenta el mismo perfil. Este sitio, no se encuentra en la cepa vacunal Onderstepoort.ANALISIS DE SECUENCIAS: las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los aislamientos presentaron un 97-99 % de homología entre sí. Idénticos porcentajes de homología, se observaron cuando se comparó la secuencia aminoacídica de la cepa Lederle con los aislamientos de campo. Sin embargo, la comparación de los aislamientos con la cepa de referencia Onderstepoort presentó una homología nucleotídica de sólo el 90% y aminoacídica 88-89%. Los datos porcentuales obtenidos respecto de las cepas locales, así como la ubicación de las variaciones aminoacídicas, confirman y extienden los datos de la literatura internacional.En el caso particular de las cepas de la CBA, se observaron mutaciones en la posición 308 (un cambio de Isoleucina por Lisina) y en la posición 310 (un cambio de Treonina por Isoleucina) que difieren de las mutaciones presentes en las cepas del resto del mundo.Asimismo, se observaron 2 posibles sitios de glicosilación adicionales a los presentes en la cepa vacunal, presentes también en aislamientos extranjeros. En este trabajo se reportan por primera vez 10 secuencias provenientes de aislamientos virales de casos clínicos estudiados en el año 2003 en la CBA. La caracterización genética de los mismos mostraría la presencia de un único genotipo circulante, diferente de la cepa vacunal. Los datos obtenidos, podrían estar relacionados con la eventual protección incompleta de las vacunas actualmente disponibles