INVESTIGADORES
GALLO CALDERON marina beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
CLONADO Y EXPRESION DEL GEN NS1 DE UNA CEPA 2C DE PARVOVIRUS CANINO EN UN SISTEMA PROCARIOTA
Autor/es:
GALLO CALDERON, MARINA; MARIANELA BUCCI; CARINA ROMANUTTI; KELLER, LETICIA; LA TORRE, JOSE
Lugar:
Vaquerias, Cordoba
Reunión:
Congreso; XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virologia; 2018
Institución organizadora:
Asociacion Argentina de Microbiologia
Resumen:
Introducción: El Parvovirus Canino es un virus altamente contagioso, que provoca gastroenteritis hemorrágicas severas en cachorros, mostrando altas tasas de morbilidad y mortalidad. Pertenece a la Familia , Género .Es un virus no envuelto, con estructura icosaédrica, y su genoma es un ADN monocatenario, de aproximadamente 5200 nucleótidos, de polaridad negativa, que codifica para 2 proteínas estructurales (VP1 y VP2) y 2 proteínas no estructurales (NS1 y NS2).Se sabe que la proteína NS1 del parvovirus canino tipo 2 (PVC-2), tiene la capacidad de inducir apoptosis y se ha mostrado que inhibe el crecimiento tumoral ?in vivo?; además la NS1 estimula al sistema inmune, dado que se exponen antígenos tumorales a las células presentadoras de antígeno, lo que produce una respuesta de células T citotóxicas.En nuestro Instituto, hemos desarrollado el diagnóstico molecular de diferentes enfermedades virales caninas, entre las cuales se encuentra el PVC. De este modo, contamos con una valiosa herramienta como lo son los genes completos de las proteínas No estructurales (NS1) de cepas locales de PVC.Objetivo: obtener un suero murino, que reconozca específicamente la proteína NS1 de PVC, para su utilización como herramienta en la detección de dicha proteína, en distintos sistemas heterólogos. Metodología: A partir de un hisopado rectal obtenido de un perro con diagnóstico positivo de PVC2c, se extrajo el ADN y se amplificó por PCR el gen completo de la NS1. Luego, se clonó en pGEM®-T Easy Vector; se subclonó en el vector pRSET(el cual permite la expresión de la proteína de interés fusionada a 6 His)y se secuenció. Se realizóla transformación de bacterias competentes y se realizaron inducciones en distintas condiciones (concentraciones de IPTG, temperatura, tiempos de inducción y medios de cultivo). Los lisados se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida al 8% yla detección de la proteína recombinante, se realizó mediante la técnica de WesternBlot, utilizando un anticuerpo comercial anti Histidina. Resultados: Se pudo demostrar la expresión de laproteína NS1 en , obteniéndose mayores niveles de expresión, realizando las inducciones con 1 mM de IPTG, a 28 °C por16 Hs en medio LB. Posteriormente, se analizó en que fracción sub-celular se obtenía la expresión mayoritaria de la proteína y se observó que NS1 se expresa solamente en la fracción insoluble. Se purificarán los cuerpos de inclusión a través de una columna de afinidad con Níquel.Conclusiones: Se logró expresar la proteína NS1 de PVC, en un sistema de expresión procariota. Si bien estos resultados son preliminares, permiten pensar que los sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteína purificada, podrán ser utilizados en la detección de NS1 en sistemas de expresión eucariota y vectores virales, que serán construidos para evaluar su efecto antitumoral.