CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN DE LA HEMAGLUTININA DE UNA CEPA ARGENTINA DE CANINE DISTEMPER VIRUS (CDV) REPLICADA EN CULTIVO DE CÉLULAS VERO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

GALLO CALDERON, MARINA; REMORINI, PATRICIA; IGLESIAS, MARCELA; MATTION, NORA; LA TORRE,JOSE

Vaquerias, Cordoba

Otro; XXVI I Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virologia; 2007

Sociedad Argentina de Virologia

INTRODUCCIÓN El virus del Distemper Canino (CDV), un miembro del Género Morbillivirus en la Familia Paramyxoviridae, es el agente causal de una enfermedad sistémica y por lo general fatal, en perros, lobos y otros carnívoros salvajes.La enfermedad se previene con vacunación; generalmente con vacunas a virus vivo modificado (VVM) que fueron desarrolladas en la década del ´60. Recientemente, se han registrado a nivel mundial y en Argentina, numerosos casos de perros enfermos en poblaciones vacunadas. Estos casos, estarían relacionados con modificaciones genéticas y antigénicas por evolución y circulación de los virus de campo. Se ha demostrado que el gen de la Hemaglutinina (H) es la región del genoma viral que presenta mayor variabilidad, por lo tanto, el objetivo de este estudio es el análisis genético y molecular de la misma. OBJETIVOEl objetivo de este trabajo fue evaluar la variabilidad genética en el gen completo de la H de una cepa local de CDV con respecto a las cepas vacunales. Asimismo, se evaluó el comportamiento de esta cepa en un cultivo de células VeroSLAM. MATERIALES Y METODOSSe recuperó el ARN viral a partir de una muestra de sangre de un animal vacunado, con sintomatología clínica compatible con CDV. La muestra, se diagnosticó como positiva para CDV mediante la amplificación por RT-PCR, de un fragmento de 287 pares de bases (pb) de la nucleoproteína (NP) viral (región altamente conservada del genoma). También, se amplificó por RT-PCR el gen completo de la hemaglutinina (H). Este fue secuenciado y las secuencias fueron analizadas con el programa Clustal W.Además, a partir de sangre heparinizada y a través de un gradiente de Ficoll-Hypaque®, se obtuvieron las células mononucleares de sangre periférica del animal infectado. Se congelaron y descongelaron 2 veces y se las utilizó para infectar una monocapa de células VeroSLAM.Estas células, desarrolladas en Japón por el Dr Yanagi, expresan la molécula de activación linfocitaria canina (SLAM), que permite una mayor eficiencia y rapidez en el aislamiento de cepas salvajes de CDV. Conclusiones RESULTADOSLa secuencia obtenida del gen completo de la H de la cepa local, presentó un 90% de identidad con respecto a la cepa vacunal Onderstepoort. Esta variabilidad del 10% estaría relacionada con la falta de reconocimiento entre los anticuerpos producidos contra la cepa vacunal y las cepas salvajes. Este mismo porcentaje de identidad, se observó entre las cepas salvajes de otras regiones del mundo como Alemania, Japón e Italia y la cepa Onderstepoort. El porcentaje de identidad de la cepa local con respecto a cepas salvajes Alemanas e Italianas fue de un 95% y de un 92-93% con respecto a cepas Japonesas.Por otro lado, durante la replicación de la cepa local en las células VeroSLAM, se observó la formación de grandes sincitios multinucleados compatibles con el efecto citopático descrito en la bibliografía para cepas de CDV aisladas en Japon.CONCLUSIONESLos resultados obtenidos, confirman y extienden resultados anteriores de nuestro laboratorio, que mostraron que es posible diferenciar molecularmente a través de una digestión con la enzima NdeI, a la cepa vacunal respecto de las cepas de campo. Los fragmentos de amplificación de 871 pb de la H (de la posición 912 al 1783) de las cepas salvajes tienen un sitio de reconocimiento para la enzima, mientras que las cepas vacunales no lo tienen.Se demostró asimismo el valor de la utilización de las células VeroSLAM para futuros aislamientos virales.