Clonado y expresión de distintas proteínas del Virus Distemper Canino para su eventual uso como inmunógenos de nueva generación.

CARINA ROMANUTTI; MARINA GALLO CALDERON; LETICIA KELLER; JOSE LA TORRE

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Introducción. El Virus Distemper Canino (VDC), miembro del género Morbillivirus, familia Paramyxoviridae, es altamente contagioso y de distribución mundial. Afecta a animales de compañía y a distintas especies silvestres susceptibles. Durante la década del 60, se desarrollaron vacunas atenuadas que junto con la aplicación de medidas preventivas, lograron controlar la enfermedad, pero recientemente se han registrado a nivel mundial y en Argentina un aumento de casos de DC tanto en animales vacunados como en no vacunados. Debido a la falta de actualización de las cepas atenuadas presentes en las vacunas comerciales, y al ser el VDC un virus con genoma a ARN, que presenta una alta tasa de mutación (10-3/10-5), provoca la aparición de cepas emergentes pobremente protegidas por los anticuerpos vacunales. Es por estos motivos que el objetivo propuesto en este trabajo, apunta al desarrollo de inmunógenos recombinantes, de nueva generación, para lograr un mejor y efectivo control de la enfermedad.Metodología. Mediante técnicas de ingeniería genética se clonaron los genes codificantes para la proteína de Fusión (F), la Hemaglutinina (H) y la Nucleoproteína (NP) viral de distintas cepas de VDC en el vector pCI-neo bajo el promotor de Citomegalovirus. Luego el ADN de estos vectores se transfectó en células BSR y a las 24 y 48 horas post transfección (hpt), se evaluó la expresión de las proteínas recombinantes por Western Blot (WB). Por otro lado, el gen de la NP se clonó en un vector de expresión procariota (pRSET-B). Luego de transformar bacterias BL21 se realizaron ensayos de inducción a distintos tiempos, para definir el tiempo óptimo de producción de la proteína recombinante.Resultados. Se pudo demostrar la expresión de las proteínas F, H y NP en células de mamíferos transfectadas con los distintos vectores y cosechadas a las 48 hpt. Por otro lado, se demostró la expresión de la NP mediante SDS-PAGE y su identidad fue confirmada por WB. El mayor nivel de expresión se obtuvo a las 5 h post inducción, tanto en la fracción insoluble como en el sobrenadante.Conclusiones. Se lograron expresar las proteínas F, H y NP del VDC en sistemas de expresión eucariotas y procariotas. Se espera poner a punto los ensayos de purificación de la NP a partir del sobrenadante de cultivos inducidos utilizando columnas de afinidad a Ni2+, para posteriormente ser utilizada como inmunógeno a proteína recombinante. Por otro lado, se espera obtener plásmidos libres de LPS, los cuales serán utilizados como posibles vacunas a ADN. Posteriormente, con los inmunógenos desarrollados, se inmunizarán ratones y se evaluará la capacidad de dichas vacunas para otorgar protección a través de ensayos de seroneutralización.