DETECCION Y CARACTERIZACIÓN POR RT-PCR Y RFLP, DE CANINE DISTEMPER VIRUS (CDV) EN PERROS VACUNADOS Y NO VACUNADOS DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES.

GALLO CALDERON, MARINA; P. REMORINI; MATTION, NORA; PERIOLO, OSVALDO; IGLESIAS, MARCELA; LA TORRE, JOSE

Congreso; XVI Reunión Científico Técnica de la AAVLD; 2006

DETECCION Y CARACTERIZACIÓN POR RT-PCR Y RFLP, DE CANINE DISTEMPER VIRUS (CDV) EN PERROS VACUNADOS Y NO VACUNADOS DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES. M. Gallo Calderón1, P. Remorini1, N. Mattion 1, O.Periolo1, M Iglesias1, J. La Torre 1 1-Centro de Virologia Animal. Centro de Ciencia y Tecnología "Dr. Cesar Milstein" Saladillo 2468 C1440FFX Buenos Aires, Argentina. marinagallocalderon@yahoo.com.ar INTRODUCCION Canine Distemper es una enfermedad viral sistémica, aguda y altamente contagiosa no solo para caninos sino para otros carnívoros salvajes. El Canine Distemper Virus (CDV), pertenece al Genero Morbillivirus, familia Paramyxoviridae y esta mundialmente distribuido. Las vacunas a virus vivo modificadas desarrolladas en la década del 60 lograron controlar la enfermedad, pero recientemente se ha observado un aumento a nivel mundial de casos de CDV tanto en animales vacunados como en no vacunados. Por otro lado, el amplio espectro de signos clínicos como consecuencia de la infección por CDV, es similar a los signos observados en otras enfermedades respiratorias y entericas de perros; es por esta razón que el diagnostico clínico resulta en ciertas ocasiones dificultoso, poniendo de manifiesto la necesidad de confirmación mediante técnicas de laboratorio. Los métodos serologicos como ELISA y seroneutralizacion, tienen poco valor diagnostico ya que, altos títulos de anticuerpos podrían detectarse como resultado de una vacunación previa o de una infección subclínica. Además durante la enfermedad severa, los títulos de anticuerpos pueden ser bajos a causa de la fuerte inmunosupresion provocada por el virus. Un diagnóstico definitivo de CDV por aislamiento viral, seria demasiado complicado y consumiría mucho tiempo. Por eso, debido a la naturaleza contagiosa y con altas tasas de mortalidad de CDV, un método especifico y sensible como la RT-PCR es necesario para comenzar rápidamente con un tratamiento adecuado. El objetivo planteado en este trabajo fue, por un lado obtener un método diagnóstico rápido y específico para CDV y por otro lado, diferenciar los aislamientos de campo de las cepas presentes en las vacunas. MATERIALES Y METODOS El ARN de muestras de sangre y de vacunas comerciales, se extrajo con Trizol. Estas muestras provenían de perros con sintomatología clínica de CDV, y eran tanto vacunados como no vacunados. Se amplificó por RT-PCR un fragmento de 287 pares de bases (pb) de la región altamente conservada del gen de la Nucleoproteina (NP) de CDV y un fragmento de 871 pb del gen de la Hemaglutinina (H), región altamente variable del genoma viral. Los ADNs purificados a partir de los productos de amplificación de la NP de 5 muestras clínicas y de una vacuna comercial, se clonaron en pGEM-T Easy Vector® para luego transformar bacterias E.Coli DH5. El ADN plasmidico se extrajo luego de unan lisis alcalina y precipitación con Polietilenglicol (PEG). Dos clones de cada fragmento se secuenciaron mediante la metodología de “single extensión” en dirección 5´y 3´. Las secuencias obtenidas, fueron analizadas y comparadas utilizando el programa Clustal W. El ADN purificado a partir del fragmento de 871 pb, fue digerido con la enzima de restricción NdeI. RESULTADOS De un total de 98 muestras analizadas, un 72% presentó amplificación positiva para la NP mediante la técnica de RT-PCR. Se observo un 100% de identidad en la secuencia aminoacidica del fragmento de la NP, entre las cepas “wild type” de Argentina y otras regiones del mundo, y las cepas vacunales. Estos datos reflejan el alto grado de conservación del fragmento amplificado. Algunas de las muestras positivas para el fragmento genomico de la NP fueron analizadas para el fragmento de 871 pb del gen de la H. La endonucleasa NdeI tiene un sitio de reconocimiento en este fragmento en las cepas de campo pero no lo tiene en las cepas vacunales; es por esto que esta técnica permite una clara diferenciación entre las mismas. DISCUSION: la metodología utilizada, permite identificar la presencia de CDV y por otro lado permite diferenciar las cepas vacunales respecto de las cepas salvajes. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman y extienden resultados anteriores resaltando además el valor diagnostico del fragmento amplificado de la NP. BIBLIOGRAFIA 1) Journal of Clinical Microbiology, Vol. 37, No. 11 Detection of Canine Distemper Virus Nucleoprotein RNA by Reverse Transcription-PCR Using Serum, Whole Blood, Cerebrospinal Fluid from Dogs with Distemper A. L. Frisk, M. Konig, A. Moritz, and W. Baumgartner. 2) Journal of Virological Methods xxx (2006) xxx–xxx Detection of canine distemper virus in dogs by real-time RT-PCR Gabriella Elia , Nicola Decaro, Vito Martella, Francesco Cirone, Maria Stella Lucente ,Eleonora Lorusso, Livia Di Trani, Canio Buonavoglia 3) Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.56, n.4, p.480-487, 2004 Detecção do gene da nucleoproteína do vírus da cinomose canina por RT-PCR em urina de cães com sinais clínicos de cinomose [Detection of canine distemper virus nucleoprotein gene by RT-PCR in urine of dogs with distemper clinical signs] C.M.S. Gebara, S.R. Wosiacki, F.J. Negrão, D.B de Oliveira,S.N.E. Beloni, A.A. Alfieri, A.F. Alfieri 4) Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper. Vet Res Commun 2005 May; 29 (4) 347-59 Jozwik A, Frymus T. 5) Veterinary Microbiology 59 (1998) 237-244 Short communication Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan Emi Yoshida, Kiyoko Iwatsuki, Naoko Miyashita, Tsuyoshi Gemma, Chieko Kai, Takeshi Mikami