Biofilm de levaduras del genero Candida, procedentes de muestras biológicas de distintas especies animales

ETCHECOPAZ ALEJANDRO; BUSTOS CARLA; GUIDA NORA

Curitiba

Jornada; XX jornadas de jóvenes investigadores de la AUGM 2012; 2012

Asociacion de Universidades del Grupo Montevideo

En todas las mucosas, existe una microbiota residente como consecuencia de sucesiones ecológicas que seleccionaron las especies mas adaptadas al sitio. La comunidad de bacterias y hongos es dinámica y diversa, y puede modificarse ante la perturbación ambiental generando interacciones beneficiosas o perjudiciales para el hospedador. El género Cándida es un grupo de levaduras con características muy diversas, con un potencial patógeno variable. Se considera a Cándida albicans (Ca) como la especie más virulenta, siendo capaz de generar con mayor frecuencia enfermedades mortales en seres humanos no inmunocompetentes. En el sentido más estricto de la palabra, no existen levaduras patógenas por naturaleza; las que están relacionadas con enfermedad en el hombre o animales, son incapaces de producir infección en un individuo sano. En los últimos 20 años se observó un importante incremento en las infecciones de origen micótico, debido probablemente a la utilización de procedimientos de diagnóstico y/o terapéuticos agresivos, así como al incremento de pacientes inmunocomprometidos. Coinfecciones bacteriales y fúngicas han sido implicadas en la colonización de las mucosas en humanos, así Ca y Escherichia coli exponen una interacción cooperativa en la cual E. coli realza la adherencia de Ca en la mucosa vesical y aumenta la probabilidad de infecciones micóticas urinarias. De modo interesante, el desequilibrio en la flora normal causada por el tratamiento con antibióticos de espectro amplio es un factor de predisposición asociado con la colonización con Ca. Las infecciones de útero en yeguas no preñadas se han hecho más frecuentes con el empleo extendido de antibióticos y la manipulación en la reproducción intensiva, siendo Streptococcus equi subsp. zooepidemiccus uno de los microorganismos más aislados de muestras de endometritis. Por otra parte, Cándida a menudo es encontrada en vagina y endometrio pero sus relaciones exactas con la enfermedad son confusas pues su recuperación en cultivo suele ser más frecuente que su participación en la etiología de la enfermedad vaginal o uterina. Los efectos cooperativos observados en infecciones ocasionadas por eucariotas y procariotas podrían ser debidos en parte a la formación de biofilms. Éstos son consorcios tridimensionales de microorganismos, que se adhieren a una superficie y son embebidos en sustancias extracelulares poliméricas. En esa comunidad heterogénea, de estructura compleja, los microorganismos conviven, cooperan, se comunican por sistemas de señales que dirigen el fenotipo y regulan la expresión de genes que nunca se expresan en las formas planctónicas y siendo más resistentes a los antibióticos, al estrés ambiental y a las defensas del hospedador. En los biofilm, la gran mayoría de las células que lo forman están irreversiblemente adheridas al sustrato, y sus componentes celulares desarrollan un fenotipo marcadamente diferente al que poseen como células planctónicas. Existen numerosos estudios sobre la dinámica de las biopelículas bacterianas, pero los estudios sobre los biofilms fúngicos son más recientes y menos abundantes. Así mismo, los estudios realizados con cepas animales son mucho mas escasos y de menor desarrollo que las investigaciones realizadas en humanos. En investigaciones anteriores demostramos la presencia de Ca en mucosa vaginal de equinos clínicamente sanos como parte de la microbiota. El estudio del comportamiento entre bacterias y hongos que coexisten dentro de comunidades microbianas en mucosas de animales, ayudaran a entender y tratar con eficacia infecciones oportunistas polimicrobianas. Los objetivos de este trabajo son: detectar la producción in vitro de biofilm de levaduras del genero Cándida, procedentes de muestras biológicas de distintas especies animales, cuantificar su producción y compararlas. Se utilizaron 8 cepas del genero Cándida aisladas de diferentes muestras biológicas animales, que incluyen especies de Ca, C. glabrata y C. tropicalis; y 2 cepas de referencia: Ca ATCC66393 y C. parasilopsis ATCC22019. Se cultivaron las cepas en CHROM-agar Candida (CHROMagar Company, Ltd., Francia) para verificar pureza e identidad a 37 ºC por 24-48 hs. Se evaluó la producción de biofilm a través del desarrollo de la técnica del portaobjetos: A partir de un cultivo en medio Saboreaud glucosado de 24hs de antigüedad, se cultivaron en caldo tripteina soja (CTS) con el agregado de 5% de suero equino y 5% de glucosa y se incubaron por 24hs. Luego, en portaobjetos contenidos en cámara húmeda, se colocó suero equino estéril y se incubó por 1hs. Se realizó una suspensión de 5×106 blastosporas/ml y se colocaron 200 ul sobre el portaobjetos, dejándolo incubar a 37 ºC por 24hs. Finalmente, se lavó 3 veces con agua destilada, se tiñó con alcian blue 2% y se observó al microscopio óptico a 10x, 40x y 100x. Se observó producción de biofilm en todas las cepas estudiadas. Definimos biofilm como aquellos aglomerados celulares que se encuentran envueltos y adheridos por una matriz extracelular que capta el colorante de alcian blue tomando un color celeste. Los biofilm observados, revelan características fenotípicas distintas entre las cepas en estudio. Todas las cepas evaluadas demostraron ser capaces de producir biofilm in Vitro. Comparándose las características fenotípicas de estos conglomerados celulares, se observó que varían notablemente en la morfología que adoptan, en la presencia o ausencia de tubo germinativo y en la cantidad de producción de matriz extracelular. Es posible que exista una correlación directa entre la capacidad productora de biofilm que demuestran las distintas cepas de Candida, con la posibilidad de permanecer en las mucosas de las diferentes especies animales. Si bien el objetivo de este estudio no era correlacionar la capacidad de formación de biofilm in vitro con la frecuencia de aislamientos que se obtienen de animales sanos y enfermos, estudios posteriores podrían dar una idea de esta relación y así poder contar con mayor cantidad de herramientas profilácticas y terapéuticas en relación a las enfermedades oportunistas producidas por el género Cándida.