Desarrollo de un test molecular simplificado en gota seca para la pesquisa neonatal del Chagas congénito

LAROCCA L; STOLOWICZ FG; THEAUX C; SMITHIUS F; MACALLINI G; DIMA E; ARANDA C; VOJNOV AA; ONETO A; CARRILLO C

Buenos Aires

Jornada; 50ª Jornadas Científicas Anuales del Hospital Dr. Carlos G. Durand; 2014

Hospital de Agudos Dr. Carlos G. Durand

**Las autoras Larocca L y Stolowicz FG contribuyeron del mismo modo al trabajo. INTRODUCCIÓN: El Chagas es una endemia americana cuyo agente etiológico es el Trypanosoma cruzi.Se estima que en Argentina, por transmisión vertical, nacen ~1.500 niños/as infectados/as anualmente; sin embargo, sólo se notifican unos 300 casos positivos a causa de las limitaciones metodológicas. OBJETIVO: Desarrollar un test de diagnóstico para Chagas congénito por amplificación molecular isotérmica (?AMI?) simplificado, que se adapte a las prácticas de laboratorio de pesquisa neonatal. Objetivo particular 1: adaptar el método AMI para utilizar, como sustrato, muestras de sangre en gota seca. Objetivo particular 2: simplificar el método de lectura del resultado a condiciones point of care (POC). MATERIALES Y MÉTODO: se utilizó una muestra de sangre negativa certificada para Chagas. Una parte se conservó como control negativo; otra fracción se inoculó con T. cruzi, en condiciones controladas de dilución seriada, para utilizar como muestras de sangre positivas. Las muestras fueron sembradas en gota, en tarjetas de pesquisa de la División Laboratorio del Htal. Gral. de Agudos Carlos G. Durand y se utilizaron como sustrato para reacciones por AMI, a distintos tiempos y temperaturas, resultando óptimos 65°C-40min. Se determinó a)- sensibilidad: en las muestras seriadas, comparativamente con Polymerase chain reaction cuantitativa (Q-PCR), revelando la reacción AMI por electroforesis (método analítico) y por cromatografía en Lateral flow dipsticks (LFD) (método a campo), por pipeteo individual de reactivos vs. mezclas de reacción; b)- especificidad: en muestras de ADN, dispensadas en tarjeta, de T. cruzi vs. humano, Crithidia fasciculata, Leishmania mexicana, T. brucei, Phytomonas spp. y Saccharomyces cerevisiae. c)- Se iniciaron pruebas de AMI con 4 muestras de sangre, dispensadas en tarjetas, remanentes del diagnóstico obligatorio para Chagas en embarazadas, de serología negativa, y se comparó con Q-PCR. RESULTADOS: a)- las muestras artificialmente inoculadas con T. cruzi dieron una sensibilidad de detección por AMI de 1-10 parásitos/muestra, valor igual o 10 veces mayor que con Q-PCR. La sensibilidad fue similar en LFD y por electroforesis y se mantuvo en ensayos simplificados, dispensados en mezclas de reacción; b)- en todos los casos, las muestras de ADN heterólogos resultaron negativas por AMI y por Q-PCR. c)- Las 4 muestras de mujeres embarazadas, dispensadas en tarjeta, resultaron negativas por AMI y Q- PCR, concordantemente con su serología. CONCLUSIONES: La adaptación del método AMI a muestras en tarjeta, en reacción y lectura simplificada, tanto en condiciones controladas como con las primeras muestras ensayadas, mantuvo la especificidad y sensibilidad descriptas para el método analítico, pero en un ensayo notablemente más simple, sin necesidad de recursos humanos y/o equipamiento complejo. Esto nos alienta a avanzar con el protocolo para la validación estadística del test, aprobado por el Comité de Ética en Investigación (Junio de 2014).