ANALISIS CELULAR Y MOLECULAR DE LA ASOCIACIÓN DE VP3, PROTEÍNA MULTIFUNCIONAL DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA AVIAR, CON COMPARTIMENTOS ENDOCÍTICOS

GIMENEZ, MARÍA CECILIA; ZANETTI, FLAVIA ADRIANA; RODRÍGUEZ, JOSÉ FRANCISCO ; COLOMBO, MARÍA ISABEL ; DELGUI, LAURA RUTH

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología, XIV Congreso Argentino de Microbiología 2016; 2016

Asociación Argentina de Microbiología

El Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV), agente etiológico de la Enfermedad de Gumboro, es un virus desnudo de simetría icosaédrica, cuyo genoma está constituido por ARN de doble cadena. La proteína viral VP3, cumple diversas funciones en su ciclo de infección, siendo protagonista del proceso de replicación. Antecedentes de nuestro laboratorio indican que VP3, tanto en el contexto de la infección como sobre-expresada en las células, se asocia a compartimentos membranosos con características endo-lisosomales no degradativos. Estos compartimentos actúan como plataforma para el establecimiento de los complejos de replicación viral.Nuestro objetivo fue abordar la caracterización molecular y celular de la asociación de VP3 a los compartimentos endosomales. En primer lugar, realizamos un análisis detallado de la asociación de VP3 a los compartimentos endosomales mediante microscopía confocal empleando células aviares que sobre-expresaban una mutante permanentemente activada de la proteína Rab5 fusionada a EGFP (EGFP-Rab5Q69L). Rab5 es una proteína residente en endosomas tempranos y la mutante empleada genera compartimentos de gran tamaño que facilitan el análisis de la distribución de VP3, en el contexto de la infección o luego de su sobre-expresión. Posteriormente, con el objetivo de conocer los residuos aminoacídicos que median la asociación, estudiamos el efecto de mutaciones puntuales en la secuencia de la proteína viral VP3, en relación a su capacidad para asociarse a los compartimentos endosomales empleando para ello marcadores de estas estructuras y microscopía confocal. Finalmente, para determinar la topología de la asociación de VP3 a dichos compartimentos, empleamos la metodología de permeabilización selectiva y diferencial a partir de la utilización del compuesto digitonina, reactivo que en determinadas condiciones es capaz de permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, sin interferir en la integridad de las restantes membranas intracelulares.Observamos que VP3 se asocia de manera discontinua, en forma de ?parches?, a los compartimentos marcados con EGFP-Rab5Q69L. Además, determinamos que ciertas mutaciones puntuales en la secuencia de VP3 eliminan su capacidad de asociación a los compartimentos endosomales, identificando el dominio de VP3 involucrado en dicha asociación. Finalmente, hemos determinado la topología de la asociación de VP3, observando que la misma se encuentra en la cara citosólica de los compartimentos endosomales.Hemos definido la morfología de localización y orientación de VP3 en las plataformas de replicación asociadas a compartimentos endosomales. Además, hemos identificado los residuos aminoacídicos que median la asociación de VP3 a dichos compartimentos.Estos resultados constituyen un importante aporte al campo de los Birnavirus ya que hasta el momento, el nuestro es el único estudio tendiente a dilucidar de forma detallada la estrategia de replicación empleada por los miembros de la familia Birnaviridae.