Construcción de vectores de transferencia para la obtención de poxvirus recombinantes que expresen antígenos del virus rábico.

GARANZINI, D. ; CARDONA, R. ; ZANETTI, F.; PEREZ, O.; CALAMANTE, G.

Valle Hermoso, Pcia. de Còrdoba

Encuentro; Reuniòn Cientìfica Anual de la Sociedad Argentina de Virologìa; 2012

Asociaciòn Argentina de Microbiologìa

Los virus canarypox (CNPV) y vaccinia Ankara modificado (MVA) se utilizan como vectores para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas contra enfermedades infecciosas. Teniendo en cuenta la efectividad de las vacunas basadas en poxvirus y que en el norte de nuestro país el virus rábico circula en animales domésticos y silvestres, nos propusimos obtener nuevas vacunas antirrábicas basadas en CNPV y MVA recombinantes. En una primer etapa construimos un CNPV que porta la secuencia codificante de la proteína G (RG) del virus rábico inserta en el gen viral CNPV048. Este virus indujo inmunidad protectora en el modelo murino. En una segunda etapa, para mejorar la respuesta inmune y/o el escalado de la producción de las vacunas, nos proponemos obtener CNPV recombinantes que expresen simultáneamente las proteínas G y N del virus rábico y MVA recombinantes que expresen la proteína G. El gran tamaño del genoma de los poxvirus descarta la manipulación directa del ADN y los poxvirus recombinantes se obtienen por recombinación homóloga entre el genoma del virus y un vector de transferencia (VT) que porta el gen de interés flanqueado por regiones genómicas que serán el blanco de inserción. El objetivo de este trabajo fue la obtención de las herramientas moleculares que permitan la obtención de MVA y CNPV recombinantes que expresen antígenos del virus rábico. En el caso de CNPV en el plásmido p134, que posee un fragmento de 427 pb que incluye la región intergénica entre los genes CNPV134 y CNPV135 (sitio blanco de recombinación), se clonaron direccionalmente (a) el promotor sintético temprano/tardío pEL de poxvirus y (b) el cassette para la expresión de la enzima beta-galactosidasa. Luego, se subclonó direccionalmente la secuencia codificante de la nucleoproteína (N) del virus rábico para obtener el VT-134-N. La actividad de la enzima marcadora se confirmó in vitro por transfección del VT en cultivos infectados con CNPV. En el caso de MVA la secuencia codificantes de RG se subclonó direccionalmente en el VT-Mtk-GUS río abajo del pEL. Este vector contiene además un cassette para la expresión de la enzima beta-glucuronidasa y secuencias flanqueantes correspondientes al gen MVA086R (sitio blanco de recombinación). En cada etapa de clonado, la identidad de las secuencias introducidas se confirmó por secuenciación. Los VT-134-N y VT-Mtk-RG se transfectaron en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo infectados con CNPV-RG o MVA, respectivamente, y se está realizando el aislamiento de los poxvirus recombinantes por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato de las enzimas marcadoras. En este trabajo se seleccionó la región intergénica CNPV-134/135 como nuevo sitio blanco de inserción en el genoma de CNPV y se construyó el VT-134-lacZ, que posee una enzima marcadora diferente, lo que permitirá la obtención de nuevos CNPV simples o dobles recombinantes. Además, se construyeron los VT-134-N y VT-Mtk-RG, herramientas moleculares indispensables para la obtención de poxvirus recombinantes que expresan antígenos del virus rábico.