CLONADO DEL GEN DE LA VP2 DE UNA CEPA 2C DE PARVOVIRUS CANINO EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTA

BUCCI MARIANELA ; ROMANUTTI CARINA; KELLER LETICIA; MATTION NORA; LA TORRE JOSE; GALLO CALDERÓN MARINA

Jornada; V JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES. Ciencia y Sociedad; 2015

Facultad de Cs. Veterinarias

Introducción: El Parvovirus Canino (PVC) pertenece a la Familia Parvoviridae, Género Parvovirus. Es un virus no envuelto, con un genoma a ADN de cadena simple, altamente contagioso, que provoca miocarditis y gastroenteritis hemorrágicas severas en cachorros, mostrando altas tasas de morbilidad y mortalidad. Desde su aislamiento, en 1978, el PVC ha sufrido cambios antigénicos. Las variantes antigénicas, PVC2a y PVC2b, reemplazaron secuencialmente a la cepa original PVC2 y se encuentran en distintas proporciones en las poblaciones caninas de todo el mundo. La última variante que se ha detectado es la PVC2c, y se ha descrito inicialmente en Italia, pero se ha diseminado a nivel mundial, y en particular, en nuestro país, es la cepa predominante. El genoma codifica para 2 proteínas estructurales (VP1 y VP2) y 2 proteínas no estructurales (NS1 y NS2). La VP2 es el componente principal de la cápside. Cada partícula viral contiene alrededor de 60 copias de VP2 y entre 6 a 10 copias de VP1. Si bien la vacunación es la manera más práctica, efectiva y económica de prevenir la enfermedad, se han reportado muchos casos de animales que aun estando vacunados, se enferman.Objetivo: Obtener el gen de la VP2 de PVC en un sistema de expresión eucariota.Materiales y Métodos: A partir de un hisopado rectal obtenido de un perro con sintomatología clínica de PVC, se extrajo el ADN y se amplificó por PCR un fragmento del gen de la VP2, obteniéndose un diagnóstico molecular positivo para PVC, y confirmando la presencia de la cepa PVC2c, por secuenciación. Posteriormente, se amplificó por PCR el gen completo de la VP2, se clonó en pGEM®-T Easy Vector y se secuenció para confirmar la identidad del mismo. El gen completo fue subclonado en el vector pcDNA?HisMaxC, el cual posee un promotor del Citomegalovirus humano, y permite la expresión de la proteína fusionada a 6 Histidinas. Se realizaron maxipreparaciones del vector vacío, y del vector conteniendo tanto el gen VP2 de una cepa PVC2c, como el de una cepa vacunal, con el fin de obtener ADN en cantidad y calidad necesarias para realizar las transfecciones correspondientes. Las transfecciones se realizaron en células Hek 293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), en un 70% de confluencia, mediante 2 métodos diferentes: el de lipofección con Lipofectamina 2000 y el de Cloruro de Calcio. A las 48 hs post-transfección para el caso de Cloruro de Calcio y a las 24 hs post-transfección para el caso de Lipofectamina, se analizaron los lisados celulares en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%. La detección de la expresión de las proteínas recombinantes se realizó mediante la técnica de Western Blot, utilizando un anticuerpo comercial anti Histidina. Luego de las incubaciones y lavados correspondientes, se expuso la membrana al anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y se realizó la detección mediante quimioluminiscencia (ECL, Pierce). Resultados: Los experimentos de Western blot muestran, en la transfección realizada con lipofectamina, la obtención de una banda de aproximadamente 70 Kda que correspondería a la VP2 de PVC, la cual no está presente en las transfecciones realizadas con el vector vacío.Conclusiones: Se logró expresar la proteína VP2 de PVC, en un sistema de expresión eucariota. Si bien estos resultados son preliminares, permiten pensar la estrategia de eventualmente, desarrollar un inmunógeno actualizado a ADN contra el Parvovirus Canino.